胃蛋白酶試劑盒的實(shí)驗原理與操作步驟及應(yīng)用,！

一、背景

胃蛋白酶試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人胃蛋白酶的含量。

二,、實(shí)驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被胃蛋白酶捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胃蛋白酶呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

三,、樣本處理及要求

1,、血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2,、血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

四,、操作步驟

1、從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3、樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。

4、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5,、棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6、每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

7,、每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

五,、實(shí)驗結(jié)果計算

以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度,。

六、應(yīng)用

用于唾液胃蛋白酶檢測對胃食管反流病的診斷價值研究：

對清晨剛醒時與三餐后1小時唾液胃蛋白酶濃度對胃食管反流病的診斷價值進(jìn)行比較,。

研究方法：采用前瞻性病例對照研究,納入108例胃食管反流病患者作為病例組及32例健康志愿者作為對照組,令所有受試者完成胃鏡檢查,。病例組根據(jù)內(nèi)鏡下有無糜爛性食管炎分為糜爛性食管炎亞組（50例）和非糜爛性反流病亞組（58例）。收集個人資料,采集唾液樣本,。

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定清晨剛醒時及三餐后1小時唾液胃蛋白酶濃度,。

結(jié)果：胃食管反流組唾液胃蛋白酶濃度明顯高于健康對照組（88.26ng/ml vs10.81ng/ml,P<0.001）。非糜爛性反流病亞組唾液胃蛋白酶濃度低于糜爛性食管炎亞組（80.51ng/ml vs 94.06ng/ml）,。胃食管反流組清晨剛醒時唾液胃蛋白酶濃度明顯高于三餐后1小時（P<0.05）,三餐后1小時唾液胃蛋白酶濃度分布無明顯差異,。糜爛性食管炎及非糜爛性反流病亞組清晨剛醒時胃蛋白酶濃度明顯高于三餐后1小時（P<0.05）,三餐后1小時唾液胃蛋白酶濃度分布無明顯差異,。以清晨剛醒時樣本胃蛋白酶濃度做出受試者工作曲線發(fā)現(xiàn),唾液胃蛋白酶診斷閾值為53.76ng/ml,曲線下面積為0.995,敏感度為95.4%,特異度為,尤登指數(shù)為0.95,。

當(dāng)以早餐后樣本為分析對象時,診斷閾值濃度為54.56ng/ml,曲線下面積為0.967,靈敏度為86.1%,特異度為,尤登指數(shù)為0.86。當(dāng)以午餐后樣本為分析對象時,診斷閾值濃度為28.26ng/ml,曲線下面積為0.979,靈敏度為95.4%,特異度為90.6%,尤登指數(shù)為0.86,。當(dāng)以晚餐后樣本為分析對象時,診斷閾值濃度為19.81ng/ml,曲線下面積為0.979,靈敏度為98.1%,特異度為87.5%,尤登指數(shù)為0.86,。由此可見,清晨剛醒時采樣的診斷價值。

結(jié)論：唾液胃蛋白酶檢測對胃食管反流病的診斷具有重要意義,并且具有高效,、簡便,、易于接受等優(yōu)勢,有望成為胃食管反流病的重要診斷工具,。清晨剛醒時作為唾液胃蛋白酶檢測采樣時間較三餐后1小時更為合適。