植物吲哚乙酸(IAA)ELISA試劑盒的操作步驟與應用！

一,、背景

植物吲哚乙酸(IAA)ELISA試劑盒用于體外定量檢測組織,、細胞及相關液體樣本中植物吲哚乙酸（IAA）的含量。

二,、實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被植物吲哚乙酸（IAA）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的植物吲哚乙酸（IAA）呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

三,、樣本處理及要求

1、血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20分鐘,，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

2、血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

3、組織勻漿：用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果）,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,，具體體積可根據實驗需要適當調整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復凍融,。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4,、細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將上清置于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。

四,、操作步驟

1,、從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2,、設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

3、棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

4,、每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。

5,、每孔加入終止液50μL，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

五、應用

用于硼對根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的調控研究：

以不同硼濃度（0（ck）,、0.05,、1、5,、10和100 mg/L）處理根瘤菌Ensifer meliloti LZgn5f（gn5f）（內源根瘤菌,來源于供試材料）和Ensifer meliloti 12531f（12531f）（外源根瘤菌）,篩選適宜硼濃度,并用此濃度處理兩菌株,研究硼對兩根瘤菌產胞外多糖,、IAA以及菌體形態(tài)結構的影響。

采用蛋白組學方法研究硼處理兩根瘤菌蛋白表達差異變化,進一步闡明硼對根瘤菌胞外多糖及IAA分泌的調控機制,。取得結果如下：

1,、添加100 mg/L硼有利于gn5f生長,1 mg/L硼有利于12531f生長;此外,100 mg/L硼處理根瘤菌gn5f、1 mg/L硼處理根瘤菌12531f,均可促進二者胞外多糖和IAA分泌量,改變根瘤菌菌體形態(tài)及表面結構,。

2,、蛋白組學分析,100 mg/L硼處理根瘤菌gn5f,有7個蛋白表達上調,47個蛋白表達下調。功能分類將這些蛋白分為細胞過程（運輸和分解代謝）,、環(huán)境信息處理（膜運輸）,、遺傳信息處理（轉錄）、代謝（全局和概覽通路）以及其他未知功能蛋白5類,其中已知功能的上調蛋白NAD依賴性琥珀酸半醛脫氫酶,、乙酰合成酶和琥珀酸半醛脫氫酶[NADP（+）])均屬于代謝（全局和概覽通路）類功能蛋白,。1 mg/L硼處理根瘤菌12531f,有3個蛋白表達上調,4個蛋白表達下調,它們可分為細胞過程（運輸和分解代謝）、遺傳信息處理（轉錄）,、代謝（全局和概覽通路）和其他未知功能蛋白4類,其中上調蛋白Uvr ABC系統(tǒng)蛋白B屬于遺傳信息處理（轉錄）類功能蛋白,天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶屬于代謝（全局和概覽通路）類功能蛋白,。

3、根據差異蛋白表達富集的主要代謝通路分析,100 mg/L硼促進根瘤菌gn5f產胞外多糖和IAA的機制為:硼通過促進NAD依賴性琥珀酸半醛脫氫酶,、乙酰合成酶,、琥珀酸半醛脫氫酶[NADP（+）]等差異蛋白上調,繼而促進丙酮酸代謝、GABA旁路代謝,谷氨酸代謝等與三羧酸循環(huán)有關的代謝通路,為胞外多糖合成提供能量及所需要的各種糖類物質（D-半乳糖殘基,D-葡萄糖殘基以及D-葡萄糖醛酸等）,繼而促進胞外多糖的合成;硼促進色氨酸的合成,然后色氨酸在相關酶的作用下經吲哚-3-乙酰胺（IAM）或吲哚-3-丙酮酸途徑合成IAA,繼而促進IAA的合成,。

1 mg/L硼促進根瘤菌12531f產胞外多糖和IAA的機制為:硼通過促進天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶蛋白表達上調,促進三羧酸循環(huán)的中間產物延胡索酸的生成,繼而促進三羧酸循環(huán)中某些代謝通路,合成胞外多糖的中間產物（單糖的重復單元）并且提供能量,單糖重復單元在非糖類殘基（乙?；⒈顽牾,；龋┬揎椣潞铣砂舛嗵?。二氫硫辛酰胺脫氫酶蛋白表達下調抑制了吲哚-3-丙酮酸途徑,間接促進了吲哚-3-乙酰胺（IAM）的形成,繼而促進IAM轉化成IAA,。

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