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常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法（－20℃、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便,，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜,。保存時(shí)菌液加量不宜過多，有些可添加保護(hù)劑,。此外,，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi),，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的,。
②干冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存,。
③液氮保存法（－196℃）：是適用范圍*的微生物保存法,。其操作步驟如下，a,、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中,，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中,。
b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時(shí),，則不需熔封,。
c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下,，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后,，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。
d,、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中,，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min,。
e,、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。
7,、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍,，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上,，從菌體中除去大部分水分后,，細(xì)胞的生理活動就會停止，因此可以達(dá)到長期維持生命狀態(tài)的目的,。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存,。
在進(jìn)行冷凍干燥時(shí),，需注意以下幾個(gè)問題：
a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度,。一般地說,，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜；菌齡以達(dá)到對數(shù)生長期為好,；若為有芽孢或孢子的微生物,，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好；菌液濃度以高為好,，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/ml,。
b、菌株號碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶內(nèi)封入標(biāo)簽,。
c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,，自來水沖洗3次后,，蒸餾水刷凈，干燥,，塞棉塞,，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥,。
d,、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖,、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等,。
8、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞,，滅菌,。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液,。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部,。每管一滴，然后轉(zhuǎn)動小試管使菌液分散在試管底部的壁上,。標(biāo)記菌名,。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH）,，管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,，蠟封。將大試管與真空泵連通,，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時(shí),，將玻璃管熔封,，置室溫暗處或冰箱保存。
儀器與材料1,、斜面菌種：絲狀真菌,、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支,。
2,、接種用具一套。
3,、滅菌物品：1ml,、5ml吸管，長滴管,，安瓶管,，9ml無菌水試管，砂土管,，液體石蠟,，脫脂牛乳。其中,，液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時(shí)或1kg/cm2壓力滅菌3次,，每次30分鐘。接著檢查是否*無菌,，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長,。最后放在60～80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂,，然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘,，或間歇滅菌3次，經(jīng)檢查無菌后備用,。
4,、P2O5，無水CaCl2各一瓶,。
5,、真空干燥器，真空泵,。
方法1,、液體石蠟覆蓋法：取待保存的菌種斜面，用5ml無菌吸管向內(nèi)加入滅菌石蠟,，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右,，若不夠此高度，則常會引起斜面抽干現(xiàn)象,。
2,、砂土管法：用1ml無菌吸管吸取0.2～0.5ml菌懸液,，滴入砂土管中，充分混勻后,，將砂土管放入真空干燥器內(nèi),，抽干，真空干燥器內(nèi)需放置無水CaCl2,。最后,，將干燥好的砂土管取出，迅速于火焰上蠟封管口,，并在室溫下或冰箱中進(jìn)行保存,。
3、冷凍干燥保藏法：
①用滅菌長滴管取出2滴（約0.1ml）無菌脫脂牛乳,，置于無菌安瓶管中,，然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液，同樣置于此安瓶管中,，充分混勻,。
②集中安瓶管，置于100ml燒杯中,，將燒杯裝進(jìn)真空冷凍干燥器的鐘罩內(nèi)，開機(jī)并開冷卻水后,，使菌液在－20℃溫度下迅速凍結(jié)成固體,，然后抽真空使水分升華，2小時(shí)后,，可以停止冷凍并在稍高的溫度下進(jìn)行干燥,，直至全干為止。
③最后取出安瓶管,，并將其與真空泵連接,，再抽真空后，迅速將安瓶管熔封,，最后冰箱保存,。
4、甘油管保藏法：在5ml菌種保藏管中,，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,，于－20℃冰箱中保存。
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