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來源：互聯(lián)網(wǎng) 整理：Disun
Martin 和Synge在1941年就提出相色譜的設(shè)想,，然而直到六十年代后期，由于各種技術(shù)的發(fā)展,，液相色譜才付諸實現(xiàn),。這種色譜技術(shù)曾被稱為高速液相色譜（HighSpeedLiquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure LipuidChromatography）,，目前使用zui多的名稱是液相色譜（High Pe-rformance LiauidChromatography,，HPLC）。液相色譜已經(jīng)廣泛地應(yīng)用,，成為一項*的技術(shù),。它的主要優(yōu)點是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快,，十幾分鐘到幾十分鐘可完成,；⑶重復性高；⑷相色譜柱可反復使用,；⑸自動化操作,，分析度高。根據(jù)分離過程中溶質(zhì)分子與固定相相互作用的差別,，液相色譜可分為四個基本類型,，即液－固色譜、液－液色譜,、離子交換色譜和體積排阻色譜,。液相色譜在生物領(lǐng)域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機酸,；⑶甾體化合物,；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類,；⑺卟啉,；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質(zhì),、酶和多肽,；⑽脂類等。
（一）渦流擴散（Eddy diffusion）
流動相碰到較大的固體顆粒,，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流,。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝,，則流動相的速度就快,；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢,，就使區(qū)帶變寬,。因此，固相載體的顆粒要小而均勻,，裝柱要松緊均一,，這樣渦流擴散小,，柱效率高。
（二）分子擴散（Moleculardiffusion）
分子擴散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運動,，也稱縱向分子擴散,。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時,，如果流速太慢,，被分離物質(zhì)停留時間長，則擴散嚴重,。
（三）質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）
被分離物質(zhì)要在流動相與固定相中平衡,，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中,，溶質(zhì)分子要在兩個液相之間進行分配,，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當流速快時,，轉(zhuǎn)移速度慢,，來不及達到平衡動相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動,，使區(qū)帶變寬,。
（四）動相流速
當流速太低時，分子擴散嚴重,，特別是在氣相色譜中尤為突出,。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降,，當達到zui低值時,，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大,。在液相色譜中,，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中,，因為物質(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部,，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會降低柱效率,。
（五）固定相顆粒大小
定相顆粒越小柱效率越高,，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動,。
一,、分類
液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法,，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法,。
（一）液－固色譜法
液－固色譜法通常稱吸附色譜法,，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠,，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠,。硅膠對溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的,，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強烈相互作用,，這些區(qū)域為活性位置，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用,。極性越強,，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中,，依靠流動相溶劑分子與溶質(zhì)分子競爭固定相互活性位置,，從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強,，因而稱強溶劑,，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構(gòu)體,，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂,，甾體化合物，脂溶性維生素,，前列腺素等。
（二）鍵合相色譜法
鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的,。鍵合相色譜法將固定相共價結(jié)合在載體顆粒上,，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊,，固定相不斷損失,，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價結(jié)合到載體上的基團都是極性基團,，如一級氨基,、氰基、二醇基,、二甲氨基和二氨基等,。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷,、已烷及異辛烷等,。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強,，洗脫能力也越強,，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同,，稱這種色譜法為正常相色譜法,。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進行分離,，它不適于分離幾何異構(gòu)體,。
2.反相色譜法
在反相色譜法中共價結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等,。流動相的極性比固定相的極性強,。反相色譜法在液相色譜法中應(yīng)用zui廣泛。在反相色譜法中,，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用,，在液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質(zhì)時,，溶質(zhì)分子之間的相互作用,、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去,?？梢姺聪嗌V中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長,，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離,。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物,。此外,，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物?？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH,，以影響溶質(zhì)分子與流動相的相互作用,，改變它們的滯留行為。另外,，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大,，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性,、脂溶性化合物的分離,。反相色譜法中的固定相是被共價結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同,，zui長的是十八烷基,，這也是使用得zui多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加,，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加,。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復來選擇色譜柱,。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物,，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用,，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加,。水是極性zui強的溶劑，也是反相色譜中zui弱的溶劑,。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑,，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑,，以得到不同強度的流動相,，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機溶劑有甲醇和乙腈,，此外,，乙醇、四氫呋喃,、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑,。
在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣,?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治觯虎诘鞍踪|(zhì)的分離,；③堿基,，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析,；⑤以及其他如幾茶酚胺類,，組胺，糖及維生素的分離,。
（三）離子交換色譜
離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團,，這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子,，按照質(zhì)量作用定律,，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候,，其可交換離子為陰離子,，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷,，可用來與流動相交換的離子就是陽離子,，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團主要是－NH2,，及－MH3+ ：陽離子交換劑的功能團主要是－SO3H及－COOH,。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力,；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑,，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力,。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離,，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱,，多肽的分離,、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸,、核苷和各種堿基的分離等,。
（一）液－固色譜法
液－固色譜法通常稱吸附色譜法,，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠,，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠,。硅膠對溶質(zhì)，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的,，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質(zhì)分子強烈相互作用,，這些區(qū)域為活性位置，硅膠與溶質(zhì)分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用,。極性越強,，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中,，依靠流動相溶劑分子與溶質(zhì)分子競爭固定相互活性位置,，從而使溶質(zhì)從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結(jié)合力強的溶劑洗脫溶質(zhì)分子的能力強,，因而稱強溶劑,，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構(gòu)體,，可用于脂溶性化合物質(zhì)如磷脂,，甾體化合物，脂溶性維生素,，前列腺素等。
（二）鍵合相色譜法
鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的,。鍵合相色譜法將固定相共價結(jié)合在載體顆粒上,，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊,，固定相不斷損失,，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
在正常相色譜法中共價結(jié)合到載體上的基團都是極性基團,，如一級氨基,、氰基、二醇基,、二甲氨基和二氨基等,。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如庚烷,、已烷及異辛烷等,。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強,，洗脫能力也越強,，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關(guān)系正好與液－固色譜法相同,，稱這種色譜法為正常相色譜法,。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進行分離,，它不適于分離幾何異構(gòu)體,。
2.反相色譜法
在反相色譜法中共價結(jié)合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等,。流動相的極性比固定相的極性強,。反相色譜法在液相色譜法中應(yīng)用zui廣泛。在反相色譜法中,，使溶質(zhì)滯留的主要作用是疏水作用,，在液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質(zhì)時,，溶質(zhì)分子之間的相互作用,、溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子從水中被“擠”了出去,?？梢姺聪嗌V中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長,，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離,。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物,。此外,，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物?？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH,，以影響溶質(zhì)分子與流動相的相互作用,，改變它們的滯留行為。另外,，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大,，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性,、脂溶性化合物的分離,。反相色譜法中的固定相是被共價結(jié)合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同,，zui長的是十八烷基,，這也是使用得zui多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加,，在反相色譜柱中溶質(zhì)由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加,。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復來選擇色譜柱,。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物,，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用,，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加,。水是極性zui強的溶劑，也是反相色譜中zui弱的溶劑,。在反相色譜中常常用和基礎(chǔ)溶劑,，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑,，以得到不同強度的流動相,，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機溶劑有甲醇和乙腈,，此外,，乙醇、四氫呋喃,、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑,。
在生化分析中，反相色譜的應(yīng)用極廣,?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治觯虎诘鞍踪|(zhì)的分離,；③堿基,，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析,；⑤以及其他如幾茶酚胺類,，組胺，糖及維生素的分離,。
（三）離子交換色譜
離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團,，這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子,，按照質(zhì)量作用定律,，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候,，其可交換離子為陰離子,，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷,，可用來與流動相交換的離子就是陽離子,，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團主要是－NH2,，及－MH3+ ：陽離子交換劑的功能團主要是－SO3H及－COOH,。其中-NH3+離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力,；-NH2及-COOH離子交換柱屬于弱離子交換劑,，只有在一定的pH值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力,。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離,，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱,，多肽的分離,、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸,、核苷和各種堿基的分離等,。
二、易出現(xiàn)的問題
（一）渦流擴散（Eddy diffusion）
流動相碰到較大的固體顆粒,，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流,。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝,，則流動相的速度就快,；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢,，就使區(qū)帶變寬,。因此，固相載體的顆粒要小而均勻,，裝柱要松緊均一,，這樣渦流擴散小,，柱效率高。
（二）分子擴散（Moleculardiffusion）
分子擴散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運動,，也稱縱向分子擴散,。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時,，如果流速太慢,，被分離物質(zhì)停留時間長，則擴散嚴重,。
（三）質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）
被分離物質(zhì)要在流動相與固定相中平衡,，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中,，溶質(zhì)分子要在兩個液相之間進行分配,，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當流速快時,，轉(zhuǎn)移速度慢,，來不及達到平衡動相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動,，使區(qū)帶變寬,。
（四）動相流速
當流速太低時，分子擴散嚴重,，特別是在氣相色譜中尤為突出,。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降,，當達到zui低值時,，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大,。在液相色譜中,，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中,，因為物質(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部,，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速咖大會降低柱效率,。
（五）固定相顆粒大小
定相顆粒越小柱效率越高,，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動,。
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