BioLector結(jié)合 PI 染色法進(jìn)行細(xì)胞裂解,、細(xì)胞應(yīng)激及毒性篩選的具體應(yīng)用,。

方法

大腸桿菌培養(yǎng)：采用 BioLector進(jìn)行大腸桿菌 Bl21（DE3）菌種培養(yǎng),，培養(yǎng)條件：溫度 37° C，振搖速度 800 rpm）,，微孔板為 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板（MTP），每孔填樣體積為800µL,。培養(yǎng)基為緩沖液濃度為 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS,。

PI 濃度：將 1mM PI 染色液溶于磷酸鹽緩沖液中配制 PI 原液,。此原液需無(wú)菌過(guò)濾并在 4° C 下儲(chǔ)存。PI 嵌入 DNA 時(shí),，為避免對(duì)用戶造成傷害,，培養(yǎng)基中的最終 PI 濃度不應(yīng)過(guò)高。在本應(yīng)用指南中,，培養(yǎng)基最終 PI 濃度應(yīng)為 5 µM,。

誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：在此培養(yǎng)案例中，通過(guò)在 7 小時(shí)后將培溫度提升至 50°C或加入純甲醇（MeOH）來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,。

測(cè)定死亡細(xì)胞：誘導(dǎo)細(xì)胞死亡后，PI 滲入細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞與 DNA 結(jié)合,，導(dǎo)致熒光偏移,，然后通過(guò)PI 濾光片模塊檢測(cè)死亡細(xì)胞的熒光信號(hào)。

結(jié)果

細(xì)胞毒性篩選：采用 BioLector 進(jìn)行PI 染色和檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞毒性篩選,。添加 MeOH 對(duì)大腸桿菌 BL21（DE3）進(jìn)行應(yīng)激培養(yǎng)，如下圖所示,。

不同濃度的MeOH作為應(yīng)急因素對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)的細(xì)胞毒性篩選

培養(yǎng) 7 小時(shí)后,，添加 27%v/v MeOH 時(shí)生長(zhǎng)停滯,，可通過(guò)散射光信號(hào)和 DO 信號(hào)檢測(cè)得出：添加 MeOH 后 DO 信號(hào)立即增至初始值（100 %），表明細(xì)胞開(kāi)始凋亡,。添加 9%v/v MeOH 導(dǎo)致散射光信號(hào)減弱,，表明生長(zhǎng)斜率下降與 DO 信號(hào)相呼應(yīng),。18 小時(shí)后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的細(xì)胞最終 PI 信號(hào)分別為 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.,。該結(jié)果對(duì)5µM PI培養(yǎng)基進(jìn)行了空白扣除。

細(xì)胞裂解的測(cè)定：如圖所示,，培養(yǎng) 7 小時(shí)后,，將溫度從 37° C 提升至 50°C 以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。散射光信號(hào)表明,，經(jīng) 5 µM PI 處理的大腸桿菌未進(jìn)一步生長(zhǎng)，熱處理 1 小時(shí)后對(duì)照組也未進(jìn)一步生長(zhǎng),。未經(jīng)熱處理大腸桿菌（+ 5µM PI）的生長(zhǎng)曲線顯示,，細(xì)菌在 11 小時(shí)前呈指數(shù)增長(zhǎng)，之后進(jìn)入穩(wěn)定期,。熱處理后大腸桿菌停止生長(zhǎng),，2 小時(shí)后,，細(xì)胞開(kāi)始裂解，因此 PI 信號(hào)呈線性增強(qiáng),，并約在培養(yǎng) 14 小時(shí)后達(dá)到飽和,。之所以延遲 2 小時(shí)，是因?yàn)闊崃吭谝后w中分布并作用于細(xì)胞需要時(shí)間,。未經(jīng)熱處理組的 PI 曲線在指數(shù)生長(zhǎng)期可觀察到背景熒光信號(hào),。

采用BioLector 通過(guò) PI 染色測(cè)定細(xì)胞裂解

應(yīng)激細(xì)胞測(cè)定：在正在進(jìn)行的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,，散射光和 PI 信號(hào)的結(jié)合有助于識(shí)別應(yīng)激細(xì)胞。在以下案例中,，大腸桿菌BL21 分別在兩種不同 MOPS 緩沖液濃度的 Wilms-MOPS 培養(yǎng)基中培養(yǎng),。下圖表示散射光,、DO 信號(hào),、pH 值和 PI 信號(hào)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。更多解析請(qǐng)見(jiàn)應(yīng)用指南《利用BioLector進(jìn)行細(xì)胞死亡的測(cè)定》。

采用 BioLector通過(guò) PI 測(cè)量應(yīng)激細(xì)胞

從上述應(yīng)用可以看到貝克曼庫(kù)爾特 BioLector高通量微生物反應(yīng)器,，不僅可以進(jìn)行48個(gè)樣品的高通量發(fā)酵,，同時(shí)在線參數(shù)檢測(cè)、補(bǔ)料和PH調(diào)控,，從而實(shí)現(xiàn)高通量菌種篩選和工藝優(yōu)化,，而且結(jié)合 PI 染色法可以進(jìn)行細(xì)胞裂解、細(xì)胞應(yīng)激及毒性篩選的測(cè)定,。