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細(xì)胞培養(yǎng)常見問(wèn)題分析解決
細(xì)胞污染
凡是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有危害的成分或者造成細(xì)胞不純的異物都視為污染,。細(xì)胞污染根據(jù)污染源可以分為化學(xué)污染,，物理污染和生物污染,。
化學(xué)污染
細(xì)胞培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基,，水要高壓蒸汽鍋滅菌,。其中,，血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基,，血清存在潛在的化學(xué)污染，此外血清成分具有不確定性,，血清對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)影響包括毒副作用等存在差異,。
物理污染
物理污染，主要指放射線,、溫度,、振動(dòng)、輻射等物理因素對(duì)細(xì)胞的破壞,。如將細(xì)胞液培養(yǎng)基等暴露于放射線或紫外線下,，會(huì)引起細(xì)胞代謝改變。恒溫培養(yǎng)箱的周圍存在能夠產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備,，可能也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在一定影響,。
微生物污染
1.細(xì)菌：細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等,。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn),，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃,，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混,，稍加震蕩，變會(huì)有很多混濁物漂起,。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn),。
處理：
在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素,，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染
保證器皿、水充分滅菌,，空氣無(wú)菌,，同時(shí)保證滅菌壓力。
2、霉菌：霉菌的污染多數(shù)是白色念珠菌,，曲霉菌,，酵母菌等。霉菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)依舊清亮不變渾濁,，倒置顯微鏡下可看見細(xì)胞之間有交錯(cuò)的絲狀,，樹枝狀菌絲，漂浮在培養(yǎng)液中,。念珠菌呈卵圓狀,，在細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。細(xì)胞被霉菌污染后,，仍可生長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會(huì)變差,。
處理：先確定污染物的種類：細(xì)菌,、真菌還是支原體。如果是霉菌污染,。迅速將污染細(xì)胞與正常細(xì)胞系隔離,，并對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用過(guò)的所有器皿工具消毒
3、支原體：支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間,，是一種獨(dú)立生活的微生物,。對(duì)熱敏感，對(duì)一般抗生素不敏感,。支原體的形態(tài)多變,，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察,，中心有高密度的密集顆粒,，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。
因國(guó)內(nèi)的血清很多數(shù)都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè),，而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一,。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細(xì)胞變化不顯著,，在細(xì)胞逐漸的培養(yǎng)中,，細(xì)胞會(huì)慢慢死亡。
支原體污染檢測(cè)：
熒光染色法：DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,，使得支原體的DNA著色,，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn),。
解決：
1.抗生素排除法：支原體污染預(yù)防比解決好,。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液,，但該法不保證有效,。推薦用量：慶大霉素200ug/ml,四環(huán)素10ug/ml，卡那霉素50ug/ml,。
2.加溫除菌：支原體不耐熱,，可以對(duì)支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌。將支原體污染的細(xì)胞放置41度中作用10小時(shí)可殺死支原體,。因高溫對(duì)細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響,，故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)細(xì)胞影響最小而能大程度的殺死支原體的時(shí)間,。
4,、黑蛟蟲：黑膠蟲污染后細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，高倍鏡下可看見不規(guī)則的運(yùn)動(dòng),。培養(yǎng)液渾濁不明顯,，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)太大影響。
解決：如果細(xì)胞出現(xiàn)黑膠蟲污染,，可增加細(xì)胞的接種密度,，提高細(xì)胞存活率。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)很好時(shí),，黑膠蟲的數(shù)量會(huì)降低,。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中堅(jiān)持要每天換液，并用緩沖液沖洗,，能夠大大降低黑膠蟲的數(shù)量,，可最終消失，偶爾在鏡下可見個(gè)別小黑點(diǎn),，但整體細(xì)胞培養(yǎng)和后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染無(wú)影響,。
細(xì)胞培養(yǎng)箱染菌清洗方法
用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅,?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后,，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移,，采用過(guò)氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）,。并把過(guò)氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí),，使其蒸汽彌漫。待過(guò)氧乙酸的氣味消散后,，再移入細(xì)胞,。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右）,。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
預(yù)防霉菌污染,，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線或雙抗,；但細(xì)胞一旦污染，制霉菌素或放線或雙抗都無(wú)法彌補(bǔ),，舍棄被污染細(xì)胞,，并將環(huán)境*消毒。如果所有細(xì)胞都污染,，可能是整體系統(tǒng)污染,，檢查所有培養(yǎng)基和器材，并重新滅菌,。針對(duì)個(gè)別污染,，首先考慮操作問(wèn)題，注意操作規(guī)范,。
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