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CCK-8 | 細(xì)胞活性檢測指南

來源:上海陶術(shù)生物科技有限公司   2022年04月22日 18:04  

在藥物篩選中,,如何高效便捷地評價(jià)藥物分子的細(xì)胞毒性呢,?做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的你,,還在苦于計(jì)算細(xì)胞活力嗎?T仔這里有妙招奧
 

? 一,、關(guān)于細(xì)胞活力 ?

細(xì)胞活力是細(xì)胞的重要指標(biāo),,其定義為某一細(xì)胞群體中活細(xì)胞的數(shù)量,。在藥物篩選的過程中,通常會(huì)通過細(xì)胞毒性和增殖試驗(yàn)來測定細(xì)胞活力,,以評價(jià)被試分子是否對細(xì)胞增殖有影響或顯示細(xì)胞毒性作用,。
 
目前已經(jīng)有多種方法相繼被開發(fā)用于檢測細(xì)胞活力、分析藥物的細(xì)胞毒性和增殖抑制作用,,這些方法依賴于不同的細(xì)胞功能發(fā)揮作用,,包括細(xì)胞膜通透性,、染料攝取、代謝活性,、酶釋放、細(xì)胞粘附,、ATP 產(chǎn)生,、輔酶產(chǎn)生、DNA 合成和核苷酸攝取活性等,。
 
其中,基于細(xì)胞膜通透性原理的染料排除法是best簡便的細(xì)胞毒性分析方法,。此外,,基于細(xì)胞代謝的細(xì)胞增殖分析方法包括 MTT, XTT, MTS, WST1, Alamar Blue,鈣黃綠素 AM,,LDH 釋放檢測,,G6PD 釋放檢測。另一方面,,基于 DNA 合成或細(xì)胞增殖標(biāo)記物的方法也的得到了廣泛使用,,例如 H3 標(biāo)記胸腺嘧啶核苷,,BrdU,,PCNA,磷酸組蛋白 H3,,Ki-67,。此外,ATP 檢測,、磺基羅丹明B 測定,、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等也是分析細(xì)胞增殖的有效方法,。
 
下面我們來看看幾種具體的方法介紹吧。

 

二,、細(xì)胞活力檢測方法 ?
 

(一)染料排除法 

染料排除法的原理是活細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┤玖吓懦谕舛兰?xì)胞無法做到,這是因?yàn)榛罴?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜,,對于通過膜通道的小分子具有高度的選擇性,。

臺(tái)盼藍(lán)(Diphenyl Blue)是一種帶負(fù)電荷的約 960 Da 的重氮染料,,它只能透過損壞的細(xì)胞膜,被死細(xì)胞吸收,。這種染料可以在體外使用,,如細(xì)胞培養(yǎng),;也可以在體內(nèi)使用,如觀察活體中的癌細(xì)胞群,;它還可用于比較不同組別在特定條件下的活細(xì)胞數(shù)量或增殖率,。臺(tái)盼藍(lán)在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞計(jì)數(shù)中應(yīng)用廣泛,,死細(xì)胞染色后在顯微鏡下會(huì)變藍(lán),活細(xì)胞不染色,,且外觀清晰,。

盡管這種方法有許多優(yōu)點(diǎn),包括經(jīng)濟(jì),、易于應(yīng)用,,但它無法區(qū)分細(xì)胞凋亡或壞死,且靈敏度非常有限,。
 

(二)基于細(xì)胞代謝的增殖分析實(shí)驗(yàn)

1.MTT 法

MTT 法基于 MTT 在線粒體 NAD(P)H 依賴型氧化還原酶催化下轉(zhuǎn)化成不溶性甲瓚,,生成的甲瓚可以反映線粒體的活性,并可由此來確定活細(xì)胞的數(shù)量,。增殖細(xì)胞具有更高的 MTT 轉(zhuǎn)化率,,而緩慢生長細(xì)胞的低代謝率導(dǎo)致了較低的 MTT 轉(zhuǎn)化率,。應(yīng)用 MTT之后,用 DMSO 或者洗滌劑十二烷基硫酸鈉去溶解甲瓚晶體,,甲瓚的濃度便可以利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測,,波長范圍為 540 到 720 nm。

MTT 法常用于分析藥物在不同條件或者濃度的細(xì)胞毒性作用,,也可用于比較藥物組和對照組細(xì)胞活力從而測定藥物的 IC50 值,,有助于確定藥物的體外作用以及預(yù)測臨床應(yīng)用,。另一方面,由于檢測期間會(huì)殺死所有細(xì)胞,,因此該方法可能會(huì)對后續(xù)的研究帶來不便,。此外,它無法區(qū)分細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用,,在細(xì)胞數(shù)目較少時(shí)結(jié)果可信度不高,。

MTT 法原理【線粒體 NADH 通過脫氫酶轉(zhuǎn)化為 NAD+,,該反應(yīng)導(dǎo)致活細(xì)胞中的黃色四氮唑鹽(MTT、XTT,、MTS 和 WST)還原為紫色的甲瓚晶體?!?/span>


2.XTT 法
與 MTT 相同,XTT 也是一種四氮唑鹽,,可用于細(xì)胞活力的比色分析,。XTT 法同樣基于線粒體 NADH 酶可將 XTT 轉(zhuǎn)化為甲瓚晶體的原理,,但與 MTT 法不同的是,,XTT 法產(chǎn)生的是水溶性甲瓚晶體,可以直接溶解于培養(yǎng)基中,,因此省略了溶解步驟。相比于 MTT 法,,XTT 法更易應(yīng)用且更適用于真菌的研究。此外,,有研究認(rèn)為 XTT 法比 MTT 法更為敏感,,相較于其它基于四氮唑鹽的檢測有更大的應(yīng)用范圍,。
 
3.MTS 法
MTS 是在 MTT 和 XTT 之后被報(bào)道的另一種四氮唑鹽,,它是一種電子偶聯(lián)劑,在 5-甲基吩嗪硫酸甲酯即 PMS 存在的情況下會(huì)被活細(xì)胞中的線粒體還原酶轉(zhuǎn)化為甲瓚晶體,。產(chǎn)生的水溶性甲瓚晶體可以直接溶解在培養(yǎng)基中,,無需溶解步驟,,可在 490-500 nm 范圍內(nèi)被檢測,。此外,與 MTT 或 XTT 相比,,MTS 溶液具有更高的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,。MTS 法可用于檢測細(xì)胞對各種細(xì)胞因子、生長因子,、細(xì)胞毒性藥物和抗癌藥物的反應(yīng)。

 

4.?WST 法
水溶性四氮唑鹽即 WST 已被開發(fā)為新一代的細(xì)胞活性測定化合物,,它同樣可在活細(xì)胞線粒體中的NADH酶作用下轉(zhuǎn)化為甲瓚晶體,。此外,,在 PMS 存在的情況下,WST-1 和 WST-8 比 XTT 及 MTS 結(jié)果穩(wěn)定性更好,、檢測靈敏度更高,。此外,,WST 法無需額外的晶體溶解步驟,其試劑具有即開即用的特點(diǎn),,能夠幫助研究者更快地完成實(shí)驗(yàn)圖片
 
5.乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)
為了分析藥物對免疫細(xì)胞的毒性,,研究者開發(fā)出了乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,,LDH)釋放實(shí)驗(yàn)。LDH 是可溶性的細(xì)胞質(zhì)酶,,在壞死或凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜破損之后被釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中,,因此,檢測 LDH 的活性可以反映藥物或者環(huán)境因素的細(xì)胞毒性。
 
測定培養(yǎng)基中 LDH 的活性包括兩步:
(1)在 LDH 的催化下,,乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,,NAD+ 還原為 NADH;
(2)利用產(chǎn)生的 NADH,,黃遞酶將四唑鹽即 INT 轉(zhuǎn)化為紅色的甲瓚產(chǎn)物,,出現(xiàn)的甲瓚可在 490-520nm 用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測定。甲瓚的水平與培養(yǎng)基中的 LDH 活性呈正相關(guān),,可以通過甲瓚的水平來反映 LDH 活性,。
 
然而,培養(yǎng)基中的 LDH 水平可能會(huì)受到內(nèi)源性 LDH 活性的污染,,并導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性的結(jié)果,,因此該方法需要進(jìn)一步的確認(rèn)。此外,,LDH 易降解,、檢測敏感度不高等缺點(diǎn)限制了該方法的應(yīng)用。

LDH 釋放實(shí)驗(yàn)

【損傷或死亡細(xì)胞釋放的 LDH 催化乳酸氧化為丙酮酸,,NAD+ 還原為 NADH 分子,。產(chǎn)生的 NADH 被黃遞酶用于將  INT(四氮唑鹽)轉(zhuǎn)化為紅色甲瓚晶體,并進(jìn)行比色測量,?!?/span>

 

(三)腺苷5'-三磷酸測定法
腺苷5'-三磷酸即 ATP ,是生物體的主要能量來源,,主要產(chǎn)生于線粒體,。ATP 高能磷酸鍵提供的能量能夠用于細(xì)胞內(nèi)所有需要能量的過程。檢測細(xì)胞總 ATP 水平可以反映細(xì)胞活力以及藥物對細(xì)胞的毒性作用,。
 
ATP 測定法基于生物發(fā)光手段檢測 ATP 水平,。通過添加天然的螢火蟲熒光素酶和熒光素在細(xì)胞 ATP 參與下發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光,可通過光度計(jì)進(jìn)行檢測,。發(fā)光的程度與細(xì)胞活力呈正相關(guān)。
 
與其他方法相比,,ATP 測定法具有時(shí)間短,、靈敏度高、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),。發(fā)光信號還可以存在較長一段時(shí)間,,使測量步驟更容易。但由于 ATP 水平的降低與細(xì)胞數(shù)量,、細(xì)胞狀態(tài)等多種情況相關(guān),,因此無法區(qū)分藥物的細(xì)胞抑制或毒性作用。此外,有研究表明在檢測鉑耐藥上皮性卵巢癌腫瘤對其他藥物的耐藥性或敏感性方面,,ATP 檢測法比其他方法更準(zhǔn)確。

LDH釋放實(shí)驗(yàn)

(熒光素酶利用細(xì)胞 ATP 催化外源性熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素,,氧化熒光素產(chǎn)生的熒光被光度計(jì)捕捉并測量。)

 

? 三,、關(guān)于CCK-8 ?

TargetMol® 可以提供細(xì)胞毒性和增殖抑制分析方法中用到的各種試劑,。此外,我們還提供 CCK-8試劑盒(含WTS-8,、1-Methoxy PMS),,進(jìn)一步讓您的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)如虎添翼。

CCK-8?作原理示意圖


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細(xì)胞活性測定產(chǎn)品推薦

名稱產(chǎn)品編號
CCK-8C0005
MTTT19029
WST-1T20067
WST-8T4018
1-Methoxy PMST4172
Fluorescein(熒光素)T1392
Diphenyl Blue(臺(tái)盼藍(lán))T18979
Luciferase(熒光素酶)TP1344

 

 

參考文獻(xiàn):

Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513

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