在藥物篩選中,,如何高效便捷地評價(jià)藥物分子的細(xì)胞毒性呢,?做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的你,,還在苦于計(jì)算細(xì)胞活力嗎?T仔這里有妙招奧
? 一,、關(guān)于細(xì)胞活力 ?
? 二,、細(xì)胞活力檢測方法 ?
(一)染料排除法
染料排除法的原理是活細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┤玖吓懦谕舛兰?xì)胞無法做到,這是因?yàn)榛罴?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜,,對于通過膜通道的小分子具有高度的選擇性,。
臺(tái)盼藍(lán)(Diphenyl Blue)是一種帶負(fù)電荷的約 960 Da 的重氮染料,,它只能透過損壞的細(xì)胞膜,被死細(xì)胞吸收,。這種染料可以在體外使用,,如細(xì)胞培養(yǎng),;也可以在體內(nèi)使用,如觀察活體中的癌細(xì)胞群,;它還可用于比較不同組別在特定條件下的活細(xì)胞數(shù)量或增殖率,。臺(tái)盼藍(lán)在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞計(jì)數(shù)中應(yīng)用廣泛,,死細(xì)胞染色后在顯微鏡下會(huì)變藍(lán),活細(xì)胞不染色,,且外觀清晰,。
盡管這種方法有許多優(yōu)點(diǎn),包括經(jīng)濟(jì),、易于應(yīng)用,,但它無法區(qū)分細(xì)胞凋亡或壞死,且靈敏度非常有限,。
(二)基于細(xì)胞代謝的增殖分析實(shí)驗(yàn)
1.MTT 法
MTT 法基于 MTT 在線粒體 NAD(P)H 依賴型氧化還原酶催化下轉(zhuǎn)化成不溶性甲瓚,,生成的甲瓚可以反映線粒體的活性,并可由此來確定活細(xì)胞的數(shù)量,。增殖細(xì)胞具有更高的 MTT 轉(zhuǎn)化率,,而緩慢生長細(xì)胞的低代謝率導(dǎo)致了較低的 MTT 轉(zhuǎn)化率,。應(yīng)用 MTT之后,用 DMSO 或者洗滌劑十二烷基硫酸鈉去溶解甲瓚晶體,,甲瓚的濃度便可以利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測,,波長范圍為 540 到 720 nm。
MTT 法常用于分析藥物在不同條件或者濃度的細(xì)胞毒性作用,,也可用于比較藥物組和對照組細(xì)胞活力從而測定藥物的 IC50 值,,有助于確定藥物的體外作用以及預(yù)測臨床應(yīng)用,。另一方面,由于檢測期間會(huì)殺死所有細(xì)胞,,因此該方法可能會(huì)對后續(xù)的研究帶來不便,。此外,它無法區(qū)分細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用,,在細(xì)胞數(shù)目較少時(shí)結(jié)果可信度不高,。
MTT 法原理【線粒體 NADH 通過脫氫酶轉(zhuǎn)化為 NAD+,,該反應(yīng)導(dǎo)致活細(xì)胞中的黃色四氮唑鹽(MTT、XTT,、MTS 和 WST)還原為紫色的甲瓚晶體?!?/span>
2.XTT 法
LDH 釋放實(shí)驗(yàn)
【損傷或死亡細(xì)胞釋放的 LDH 催化乳酸氧化為丙酮酸,,NAD+ 還原為 NADH 分子,。產(chǎn)生的 NADH 被黃遞酶用于將 INT(四氮唑鹽)轉(zhuǎn)化為紅色甲瓚晶體,并進(jìn)行比色測量,?!?/span>
LDH釋放實(shí)驗(yàn)
(熒光素酶利用細(xì)胞 ATP 催化外源性熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素,,氧化熒光素產(chǎn)生的熒光被光度計(jì)捕捉并測量。)
? 三,、關(guān)于CCK-8 ?
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CCK-8?作原理示意圖


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名稱 | 產(chǎn)品編號 |
CCK-8 | C0005 |
MTT | T19029 |
WST-1 | T20067 |
WST-8 | T4018 |
1-Methoxy PMS | T4172 |
Fluorescein(熒光素) | T1392 |
Diphenyl Blue(臺(tái)盼藍(lán)) | T18979 |
Luciferase(熒光素酶) | TP1344 |
參考文獻(xiàn):
Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513
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