德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略,,并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。
從感染性疾病到癌癥再到各種罕見疾病,,mRNA在各種疾病中都顯示出潛在的治療價(jià)值,。
然而,mRNA分子不穩(wěn)定,,易降解,,通常需要對mRNA天然堿基進(jìn)行修飾,如capping, tail, modification和replace,。
例如,兩種正式推出的病毒mRNA疫苗的mRNA分子都進(jìn)行了不同程度的特殊修飾,。
這些特殊修改的效果如何?這也是科學(xué)家需要深入研究和解決的問題,。準(zhǔn)確定量的鑒定mRNA的修飾位點(diǎn)和修飾方法是深入分析mRNA修飾功能和機(jī)制的前提,也為提高mRNA的穩(wěn)定性和效率提供了新的方向,。
德國科隆大學(xué)的研究人員提出了一種對mRNA進(jìn)行雙重化學(xué)修飾的策略,并評估了這些修飾對mRNA功能的影響,。
在這項(xiàng)研究中,,該團(tuán)隊(duì)在mRNA轉(zhuǎn)錄過程中引入了第三個(gè)堿基對,將非自然的核苷酸引入到特定的位點(diǎn),,同時(shí)結(jié)合自然的mRNA修飾方法。
研究發(fā)現(xiàn),,雙化學(xué)修飾的mRNA可以形成協(xié)同效應(yīng),,提高mRNA的穩(wěn)定性、效率和蛋白表達(dá),。
本團(tuán)隊(duì)利用該方法對mRNA進(jìn)行標(biāo)記,,并進(jìn)一步研究了人工修飾核苷酸對mRNA效率和穩(wěn)定性的影響,。
“我們研究了這種化學(xué)修飾的mRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性,合成的mRNA是否可以用作細(xì)胞中高效蛋白質(zhì)生產(chǎn)的模板,,以及化學(xué)修飾對翻譯成蛋白質(zhì)的影響”,,肖爾教授說:“研究結(jié)果表明,,這種新方法在監(jiān)測mRNA進(jìn)入細(xì)胞、監(jiān)測和影響其在細(xì)胞水平的傳播以及信息轉(zhuǎn)錄的效率方面非常有效,?!?/span>
該研究成果已被《Chemical Science》雜志接受。
這項(xiàng)研究是由科隆大學(xué)有機(jī)化學(xué)研究所的斯蒂芬妮·卡特-肖爾教授領(lǐng)導(dǎo)的,,她從2020年開始在科隆大學(xué)化學(xué)系擔(dān)任教授,。
實(shí)驗(yàn)室主要研究方向?yàn)楹怂峄瘜W(xué)和化學(xué)生物學(xué),包括功能RNA-核酸化學(xué)修飾,、催化RNA和非編碼RNA功能研究,。
根據(jù)研究小組的說法,,這種方法有望為開發(fā)更有效的mRNA療法開辟新的可能性。
雙化學(xué)改性,,達(dá)到協(xié)同增效
目前,,有多種修飾技術(shù)可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的mRNA,,大致可分為三類:用人工合成的非天然核糖核酸代替天然核糖核酸合成mRNA;添加5′caps,、3′poly(A)“尾”和UTR(未翻譯區(qū))序列,;并采用特殊的新型配方技術(shù),有效保護(hù)mRNA,。
其中,人工合成非天然核糖核酸取代天然核糖核酸合成mRNA是較為常用的方法之一,。真核mRNA上的化學(xué)修飾大致可以分為三類:甲基化,、偽尿苷(Ψ)和次嘌呤。
經(jīng)過研究和工業(yè)應(yīng)用,,該方法可以降低mRNA固有的免疫原性和不穩(wěn)定性。例如,,Moderna和BioNTech的mRNA疫苗都使用偽尿嘧啶修飾來維持mRNA的穩(wěn)定性。
隨著mRNA治療的不斷發(fā)展,,學(xué)術(shù)界和工業(yè)界一直在尋找更多的改進(jìn)方法,,以提高mRNA的效率和穩(wěn)定性,。深入分析這些修飾對mRNA的功能影響,,是控制mRNA結(jié)構(gòu),、提高其穩(wěn)定性和翻譯活性的重要基礎(chǔ)。
為了進(jìn)一步研究這些化學(xué)修飾對mRNA的影響,,Stephanie kat - schorr的團(tuán)隊(duì)提出了結(jié)合位點(diǎn)特異性插入合成核苷酸和自然堿基修飾的想法,。
在他們的實(shí)驗(yàn)中,,通過在DNA到RNA的酶轉(zhuǎn)錄過程中引入第三個(gè)堿基對,他們在3 ' -UTR處插入了合成的核苷酸,,包含了Ψ和5mC(甲基化修飾),。,并設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)來觀察,、量化和驗(yàn)證mRNA的功能。
重要的是要注意,引入合成核苷酸通過基因轉(zhuǎn)錄(GENAEXT)字母擴(kuò)張建立在以前的工作由各自的團(tuán)隊(duì)一郎Hirao弗洛伊德Romesberg,他在2018年發(fā)表的研究指出,不自然的堿基對可以轉(zhuǎn)錄精度高,、效率高,。
在此基礎(chǔ)上,通過將功能化的非自然核苷酸具體引入長mRNA片段進(jìn)行了改進(jìn),。
在這項(xiàng)研究中,科隆大學(xué)團(tuán)隊(duì)在體外合成了功能化和編碼蛋白質(zhì)的GENAEXT mRNA,,其中包括CP修飾,,可以編碼紅色熒光報(bào)告蛋白mCherry。
具體包括在3 ' -UTR區(qū)域插入環(huán)丙烯(CP),, mRNA上Ψ和5mC修飾以提高其活性,,以及引入5 ' cap和3 ' tail修飾。
然后,,將修飾后的mRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA水平和mCherry報(bào)告基因的表達(dá),,并與cp修飾的GENAEXT mRNA與未修飾的mRNA的翻譯效率進(jìn)行比較,。
數(shù)據(jù)表明,,經(jīng)過雙重化學(xué)修飾方法(自然堿基修飾和CP非自然堿基對插入)的mRNA在細(xì)胞內(nèi)翻譯可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),這種合成的mRNA可以增加蛋白表達(dá),,提高轉(zhuǎn)染效率,、有效性。
此外,,cp修飾的mRNA在活細(xì)胞中通過反電子需求Diels-Alder (iEDDA)反應(yīng)進(jìn)行熒光標(biāo)記。
用四嗪熒光團(tuán)衍生物對合成的mRNA進(jìn)行iEDDA處理后,,研究人員可以通過共聚焦熒光顯微鏡觀察活細(xì)胞中的mRNA,,同時(shí)也可以在時(shí)間和空間上跟蹤mRNA。
iEDDA:一種無催化劑的點(diǎn)擊反應(yīng)(環(huán)加成反應(yīng)),,具有生物相容性好,、反應(yīng)特異性高、反應(yīng)速度快,、毒性低等優(yōu)點(diǎn),。
為了評估mRNA轉(zhuǎn)染過程中的細(xì)胞狀態(tài)和活細(xì)胞中的click反應(yīng),,他們還進(jìn)行了細(xì)胞活力測定。
釋放更多的mRNA潛能?
事實(shí)上,,從mRNA序列進(jìn)入細(xì)胞到引導(dǎo)細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的過程存在許多困難,,包括在進(jìn)入細(xì)胞之前被無處不在的RNAse水解成小核苷酸分子;穩(wěn)定表達(dá),等等,。
如前所述,利用人工合成的非天然核苷酸取代天然核苷酸合成mRNA已經(jīng)是常用的mRNA修飾方法之一,。
同時(shí),,通過在特定的mRNA片段中引入人工合成的非天然核苷酸,證明了修飾mRNA的可行性,。在本研究中,,該團(tuán)隊(duì)將這兩種方法結(jié)合起來,提高了蛋白質(zhì)合成效率和轉(zhuǎn)染效率,。
因此,研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,,他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,,GENAEXT方法的使用將為mRNA修飾的研究提供新的思路。
“這種方法可能為mRNA修飾開辟新的可能性微調(diào)mRNA的特性,,并通過共價(jià)載體系統(tǒng)將mRNA高效傳遞到細(xì)胞中,”該團(tuán)隊(duì)指出,,他們已經(jīng)通過一系列的研究表明,,原則上,,GENAEXT方法可以應(yīng)用于任何長度的mRNA序列,而與四嗪衍生物的iEDDA click反應(yīng)將使mRNA更功能化,。
此外,該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,,通過在mRNA的非翻譯區(qū)引入人工調(diào)節(jié)元件,,調(diào)控mRNA翻譯水平的潛力可能被解鎖,。
同時(shí),他們提到,,該方法除了能夠在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中附著各種報(bào)告基團(tuán)外,,還具有應(yīng)用于體外蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以鑒定mRNA結(jié)合蛋白的潛力。
此外,,該團(tuán)隊(duì)提出的方法還將為檢測修飾后mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)效率提供一個(gè)新的“把柄”,。目前,,科學(xué)家們已經(jīng)在定量和高通量兩個(gè)方向開發(fā)了多種方法,。
更常用的方法包括通過結(jié)合特異性抗體的高通量富集,,化學(xué)小分子/化學(xué)小分子衍生物的富集,,以及特殊性質(zhì)。測序技術(shù),。
對于下一個(gè)計(jì)劃,研究小組表示,,他們正在開發(fā)更有效地包裝mRNA的方法,,以更好地保護(hù)mRNA,使其順利進(jìn)入細(xì)胞,。
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