很多小伙伴在對膠片印跡進行短暫曝光后,，檢測不到目的蛋白?？蓮囊韵聨讉€方面來優(yōu)化實驗步驟：

1,、裂解物制備
每道全細胞提取物的 20–30 ?g 總蛋白，通常足夠用來檢測,。如果靶標蛋白的基礎(chǔ)水平,，或蛋白質(zhì)修飾程度低，可能需要通過化學(xué)刺激劑來誘導(dǎo)表達或修飾,。你可能要調(diào)查備選細胞系或組織,，其所含的目的蛋白含量更高。應(yīng)將樣品溶解于適當?shù)木彌_液中,，該緩沖液包含蛋白酶抑制劑和針對磷酸化目標的磷酸酶抑制劑,。應(yīng)務(wù)必對裂解物進行超聲處理,，以確保有效的染色質(zhì)和膜結(jié)合靶標的蛋白質(zhì)提取。請查看我們網(wǎng)站上的對照物表,，獲得推薦的陽性對照物和處理方法,。

2、一抗稀釋和/或孵育
使用推薦的封閉劑（5% BSA 或 5% 脫脂奶粉）,，以推薦的稀釋度溶解于 TBST 中,，在 4°C 下，過夜孵育一抗,。使用備選封閉劑,，如明膠、血清,、無蛋白封閉劑,、酪蛋白、或混合封閉劑,，可能降低靶標信號強度,。如需單個抗體的優(yōu)化結(jié)果，請查詢產(chǎn)品數(shù)據(jù)表找到推薦的稀釋緩沖液,。

3,、SDS-PAGE 凝膠選擇
一般來說，推薦采用 Tris-Glycine 凝膠,。但是,，對于高分子量蛋白質(zhì)，我們推薦采用 Tris-Acetate 凝膠和相關(guān)緩沖液,。蛋白質(zhì)從 1 毫米凝膠轉(zhuǎn)移比從 1.5 毫米凝膠轉(zhuǎn)移更有效,。使用更厚的凝膠，可能會導(dǎo)致高分子量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移不*,，所以我們推薦監(jiān)測轉(zhuǎn)移效率，根據(jù)目的靶標蛋白質(zhì)分子量大小,，優(yōu)化轉(zhuǎn)移條件,。

4、轉(zhuǎn)移和膜
可通過延長轉(zhuǎn)移時間或使用更高的電壓,，可改善轉(zhuǎn)膜不*,。一般來說，我們建議在轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲醇,，然后在 70 V 電壓下進行為時 2 小時的濕轉(zhuǎn),。對于高分子量蛋白質(zhì)，我們建議減少轉(zhuǎn)移緩沖液中的甲醇至 5%,，以提高轉(zhuǎn)移效率并避免大分子蛋白質(zhì)在凝膠基質(zhì)中固定,，并且在 70 V 電壓下延長轉(zhuǎn)移時間至 3 小時。檢測較小的蛋白質(zhì)時，可能在轉(zhuǎn)膜期間出現(xiàn)過度轉(zhuǎn)移（過膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移）問題,。對于小蛋白質(zhì)分子,，使用孔隙大小為 0.2 ?m 的膜并在 70 V 電壓下進行為時 1.5 小時的濕轉(zhuǎn)，而不是使用孔隙大小為 0.45 ?m 的膜或進行過夜轉(zhuǎn)移,，這樣做很重要,，因為后者可能會導(dǎo)致過度轉(zhuǎn)移和丟失小蛋白質(zhì)分子信號。

5,、封閉
膜封閉時間過長可能會掩蓋抗原表位,，并阻止抗體結(jié)合。在室溫下僅封閉 1 小時,。

6,、洗滌
洗滌時間超過推薦的三次 5 分鐘是一個常見問題，可能會導(dǎo)致減少信號,。我們推薦計時洗滌,，以確保準確性。TBST 應(yīng)包含 0.1% Tween? 20,。這適用于一抗和二抗孵育后的洗滌步驟,。此外，我們建議在 TBST 中洗滌,，因為已有數(shù)據(jù)顯示在 PBST 中洗滌會導(dǎo)致減少信號,。

7、二抗稀釋和/或孵育
可用相同的細胞提取物和一抗在印跡上進行二抗的梯度稀釋,，以優(yōu)化二抗?jié)舛?。?wù)必在室溫下，在含 5% 脫脂奶粉的 TBST 中孵育二抗 1 小時,。避免在 HRP-偶聯(lián)二抗的緩沖液中加入疊氮hua鈉,，因為疊氮化物會抑制 HRP 的活性。

8,、檢測試劑
采用能用抗-生/物素-HRP 進行檢測的生物/素化分子量標準作為化學(xué)發(fā)光檢測的陽性對照物,。