明膠酶譜試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)！

產(chǎn)品描述：

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,，活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,，友稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì),，膠原酶參與胚胎發(fā)育,、形態(tài)發(fā)生、組 織重塑等過程,，并參與炎癥,、腫瘤,、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程,。血漿與組織中的 MMP-2,、MMP-9 參與各種生理與病理過程，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視,。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2,、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為使用的,、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,，其靈敏度可達(dá) 1 nM，高于 ELISA 方法 2,，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳， 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育,，凝膠染色與脫色,。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景,，但在有蛋白酶條帶的位置,，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域,，從而能同時(shí)指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2,、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,，可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性,，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測,，如果小膠加樣孔為 10~15個(gè),，則總計(jì)可檢測 500~750 個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 oC,；
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 oC,；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋,；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 oC,。

實(shí)驗(yàn)步驟（僅供參考）

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠,。將 10 × substrate G 融化,，并 90 oC 加熱 5 分鐘,。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,，等待凝膠聚合,。

2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣,。切勿加熱變性,，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,，使用普通蛋白預(yù)染  Marker 即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人,、小鼠,、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合，取 5-15µl 上樣,。

3. 低電流恒流電泳,，每一塊小膠電流為 20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳,。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠，放入容器內(nèi).可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,，然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液,。

5.  孵育：倒掉 Buffer A,。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37oC 孵育 1~5 小時(shí),。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時(shí)即可顯示,。如 MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為 10 小時(shí)或 過一夜,。

6.  顯色：倒掉 Buffer B,，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染,，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性,。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透明條帶,。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑,。解決 辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色.MMP條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式,。

本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途,！