摘要：質粒DNA粘附在細菌細胞表面,，經過熱擊處理,，促進吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,，再在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長,。

  一、實驗原理

  質粒DNA粘附在細菌細胞表面,經過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA,。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長,。

  二,、實驗器材

  旋渦混合器，微量移液取樣器,，移液器吸頭,，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架,，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C,，恒溫搖床,，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺,，酒精燈,，玻璃涂棒，電熱恒溫培養(yǎng)箱,。

  三,、實驗試劑

  培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素）,，無ddH2O,，IPTG，X-gal,。

  四,、實驗準備

  無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）,、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）,，20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配）,。

  五,、操作步驟

  （1）事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

       （2）從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100μl）感受態(tài)菌,插入冰上融化,，冰浴5~10min,。

  （3）加入5μL連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100ng）,，輕輕震蕩后放置冰上20min,。

  （4）輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,，然后迅速放回冰中，靜置3~5min,。

  （5）在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μL LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻,，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。

  （6）在超凈工作臺中取上述轉化混合液100~300μL,，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,，待其冷卻后再涂）,。

  （7）如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,，8μL 20% IPTG,，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

  （8）在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記,，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,，再倒置過來放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱過夜。

  （9）在桌面上噴灑70%乙醇,，擦干桌面,，寫實驗報告。

  （10）觀察平板上長出的菌落克隆,，以菌落之間能互相分開為好,，注意白色菌斑。