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外泌體（Exosome）發(fā)現(xiàn)于1986年,，是一種直徑約30~100nm的雙層膜囊泡狀結(jié)構小體,，可由機體內(nèi)多種細胞如免疫細胞、干細胞,、心血管細胞,、網(wǎng)織紅細胞、血小板、神經(jīng)細胞和腫瘤細胞等主動分泌產(chǎn)生,，廣泛分布于外周血,、尿液、唾液,、乳汁,、腹水、羊水等體液中,。
外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)（如細胞因子,、生長因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質(zhì),，在體內(nèi)參與細胞通訊,、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程,，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關[1][2],。由于外泌體的特殊結(jié)構和功能，使得它具有潛在的應用價值,，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標,，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療,。
外泌體的分離純化一直是科研工作者關注的問題,，獲得高純度的外泌體對后續(xù)的研究至關重要。據(jù)了解,，目前人們多采用超速離心,、免疫磁珠、超濾,、沉淀或試劑盒等方法實現(xiàn)外泌體的提取分離：
1,、超速離心法（差速離心）超離法是常用的外泌體純化手段，采用低速離心,、高速離心交替進行（如圖所示）,，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單,，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎,，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關）,，純度也受到質(zhì)疑,；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害,，從而降低其質(zhì)量[3],。
2,、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層,，是一種區(qū)帶分離法,。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集,。此法獲得的外泌體純度較高,，但步驟繁瑣，耗時,。
3,、超濾離心：由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質(zhì),，利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離,，便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效,，且不影響外泌體的生物活性,，是提取細胞外泌體的一種新方法。
4,、磁珠免疫法：外泌體表面有其特異性標記物（如CD63,、CD9蛋白）[5]，用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合,，即可將外泌體吸附并分離出來,。磁珠法具有特異性高、操作簡便,、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點,，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響,，不利于下游實驗,，難以廣泛普及。
5,、PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關,。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性）,，顆粒大小不均一,，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等,，因此發(fā)表文章時易受質(zhì)疑,。
6、試劑盒提?。航鼛啄陙?，市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分,，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化,，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。這些試劑盒不需要特殊設備,，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代,，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來,。有些試劑盒操作簡便,，不用超速離心，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體——如101bio開發(fā)的系列試劑盒,，可分別針對尿液,、血液、細胞上清液等多種樣品進行提取[6][7],，并可進一步從外泌體中獲得想要的蛋白質(zhì)或者RNA分子,，方便快速，因而受到大多數(shù)人的歡迎,，并發(fā)表了不少高質(zhì)量的文章,！
然而，市場上各類產(chǎn)品純化效果良莠不齊,，目前仍沒有絕對的方法或試劑盒能滿足所有要求,，從各類樣品中分離到理想的外泌體。
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