甘油檢測(cè)試劑盒（組織,，細(xì)胞）的原理

上海信帆生物供應(yīng)的甘油檢測(cè)試劑盒是檢測(cè)組織和細(xì)胞中甘油含量,，除此之外我們還有專門檢測(cè)液體樣本中甘油含量的試劑盒供應(yīng)。

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物,。與游離脂肪酸一樣,，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)更加方便,。本試劑盒采用優(yōu)化步驟,，能夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量,，線性范圍為10-1200µmol/L

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油,，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化

氫；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺,，其光密度值與甘油濃度成正比,。

適用范圍：測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度,。組成 (105 次微板測(cè)定或 30 次 1 ml 比色杯測(cè)定)：

(1) 裂解液 50 ml 

(2) R1 試劑 16 ml

(3) R2 試劑 4 ml 

(4) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml

4 oC,，儲(chǔ)存 3 月。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀,、生化分析儀或 721,、722 型可

見(jiàn)光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng) 550nm,，如無(wú)此波

長(zhǎng)建議優(yōu)先選用 570nm,、次選 530、490nm,。

一 組織細(xì)胞裂解 

細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解： 消化,、離心收集細(xì)胞?；蛑苯釉谂囵B(yǎng)皿內(nèi)裂解,。通常6孔板單孔約2x106個(gè)細(xì)胞，75cm2瓶約1x107細(xì)胞,。按比例每 1~2 x 106細(xì)胞加 0.1ml 裂解液,，混勻，靜置 10 分鐘,。

動(dòng)物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存,。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切,、稱重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差,。離心管精確稱重,，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織量(約 100mg),。強(qiáng)烈建議按比例每 1mg 組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差,。（注意；裂解液用量在 1ml 或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提?。?。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法,，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量）,，而后,，靜置 10 分鐘。

二. 裂解液處理： 

1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中,，進(jìn)行步驟

2 的操作,。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量或－20oC 儲(chǔ)存。

2. 70oC 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶,，可能出現(xiàn)絮狀沉淀,。

3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定,。

三 工作溶液配制：按 4:1 比例,，取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天,，變色棄去,。（注意：謹(jǐn)防來(lái)源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來(lái)自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等,。）

四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水,、生理鹽水或與樣品緩沖液*的液體，將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000,、500,、250、125,、62.5,、31.25、15.625,、7.8125µmol/L,，通常取其中 4~6 管即可，注意設(shè)置 0 濃度對(duì)照反應(yīng)管,。

五 甘油測(cè)定 

1. 參見(jiàn)下表加樣,。待測(cè)樣品體積 10µl,，多加可能會(huì)抑制反應(yīng)。

2. 37oC 或 25oC 反應(yīng) 10 分鐘,。反應(yīng)平衡后顏色在60 分鐘內(nèi)穩(wěn)定,。

3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管 OD 值,。

4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度,。

附 Excel 作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸,。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù),，點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx擇-散點(diǎn)圖-,，點(diǎn)擊-完成-,。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-,，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-,，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R2 值-。

5. 以每 mg 蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量,。見(jiàn)說(shuō)明書

說(shuō)明： 

1.血紅蛋白>2g/L,、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇,、巰基乙醇,、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

2.紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成磷酸甘油影響測(cè)定,。

參考文獻(xiàn)： 

1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

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