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細胞復(fù)蘇
細胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”,，復(fù)蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時的冰晶迅速融化,，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶,，對細胞造成損害。
復(fù)蘇準備
●打開水浴鍋加熱至37℃,。
● 超凈臺上放好離心管(一般15ml的),，細胞培養(yǎng)瓶，移液管,，紫外滅菌至少20至30分鐘,，吹風(fēng)5至10分鐘除去臭氧。
● 37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細胞的培養(yǎng)液,，也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液,，根據(jù)細胞情況選擇。
●向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液,，從液氮罐或-80℃中取出凍存細胞,，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動，待融化后(約2min即可)立即將解凍的細胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中,，800-1000rpm下離心5min,，棄上清,，加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細胞后轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻,，標好細胞名稱,、代數(shù)、復(fù)蘇日期,，顯微鏡下觀察后放入37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細胞過夜即可貼壁,，換液和傳代時間根據(jù)不同細胞生長情況而定,。
細胞復(fù)蘇注意事項
?復(fù)蘇時動作要快，盡量減少胞內(nèi)形成冰晶,，影響復(fù)蘇后細胞活率,。
? 融化時盡量不要碰到管口，以免容易造成污染,。
?若一次性需要復(fù)蘇細胞很多,，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細胞融化時間延長,。
?若需要同時復(fù)蘇好幾種細胞,，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標記，或記住自己擺放的位置,，不要弄混亂,。
細胞傳代培養(yǎng)
1. 懸浮細胞傳代
待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃，在已紫外滅菌后的超凈臺上吸出或倒出細胞懸液至離心管中(根據(jù)細胞液的量選擇15ml或50ml離心管),，800-1000rpm下離心5min,，棄去營養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)液，加預(yù)熱好的*培養(yǎng)液適量,，輕輕吹打重懸細胞后,，吸取適量細胞懸液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，或直接取適量細胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,，再補加一定量新鮮*培養(yǎng)液進行傳代,，有些脆弱的細胞用自然沉降法沉降細胞，吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的*培養(yǎng)液后吹散進行傳代,。傳代接種的細胞密度根據(jù)不同細胞生長情況而定,，一般間隔1-2天即可傳代一次。
2. 貼壁細胞傳代
待培養(yǎng)瓶底中細胞覆蓋率達70%-80%時,，在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺上,，棄去舊細胞培養(yǎng)液，用無菌1*PBS洗滌瓶底細胞1-2次,，用1ml(T25培養(yǎng)瓶)或2ml(T75培養(yǎng)瓶)trypsin溶液37℃下作用細胞,，待顯微鏡下細胞回縮變圓,，少部分細胞出現(xiàn)流沙狀時，快速吸去trypsin溶液,，加預(yù)熱好的新鮮*培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打使細胞脫落且分散均勻，直接吸取適量細胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中,，或800-1000rpm下離心去上清,，加適量新鮮*培養(yǎng)液吹打重懸細胞，然后轉(zhuǎn)移適量細胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,，再加入一定量*培養(yǎng)液,，搖勻瓶底細胞液后進行培養(yǎng)。
細胞傳代培養(yǎng)注意事項
? 吹打時每次不要排完移液管中液體,，同時控制吹打節(jié)奏,，這樣不容易吹出泡沫，泡沫對細胞有損傷作用,，而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒有*吧細胞吹打下來,。
?不要等到貼壁細胞*鋪滿瓶底，要留有一定空隙時細胞狀態(tài)才良好,。
?消化時最好不要等到細胞成片飄起,，否則細胞狀態(tài)受影響且第二天培養(yǎng)中死細胞較多。
細胞凍存
凍存的細胞要處在指數(shù)生長期,。懸浮細胞和貼壁細胞經(jīng)離心后用凍存液重懸,，計數(shù)，凍存的細胞密度一般3*106-1*107 cells/ml,，最好不少于1*106 cells/ml,，否則復(fù)蘇后難以養(yǎng)起來，將重懸計數(shù)后的細胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中,，迅速擰緊蓋子，放入梯度凍存盒然后置于-80℃過夜,，也可以先4℃放置30分鐘,，再-20℃放置1-2小時，最后-80℃過夜(16-18小時),，若梯度凍存盒不夠或無凍存盒,，可以將凍存管置于泡沫盒中，用棉花包起來,，棉花厚度約1cm,，置于-80℃過夜，第二天取出-80℃細胞存放至液氮罐中,，并在記錄好存放位置信息,。
凍存準備
●配制好凍存液,。一般凍存液為培養(yǎng)液，血清,，DMSO按照7:2:1的比例配制,，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪種凍存液配制,，血清多多益善,，但DMSO都不可以多，以免對細胞造成損傷,。
●準備好凍存管,，標上細胞名稱，代次,，凍存批號,，凍存日期。
●準備好細胞程序降溫盒或凍存用的材料,，程序降溫盒放置室溫后使用,。
細胞凍存注意事項
?程序降溫盒有無需有毒異丙醇填充的，有利于實驗人員身體健康,。
?DMSO有毒且皮膚會吸收,，做好防護措施。DMSO本身不長菌,，不需要做滅菌處理,。
?由-80℃轉(zhuǎn)至液氮時迅速，避免溫度上升影響細胞活性,。
?每個凍存管不要加入體積太多,，以免凍存時凝固體積膨脹，撐開凍存管,，且在下次復(fù)蘇時,，融化較慢，導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞存活率不高,。
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