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細(xì)胞復(fù)蘇
細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶”，復(fù)蘇時(shí)一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37℃,，使胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化,，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害,。
復(fù)蘇準(zhǔn)備
●打開(kāi)水浴鍋加熱至37℃,。
● 超凈臺(tái)上放好離心管(一般15ml的)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，移液管,，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風(fēng)5至10分鐘除去臭氧,。
● 37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液,，也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液,，根據(jù)細(xì)胞情況選擇。
●向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液,，從液氮罐或-80℃中取出凍存細(xì)胞,，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動(dòng)，待融化后(約2min即可)立即將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中,，800-1000rpm下離心5min,，棄上清，加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，輕晃使瓶底液體分散均勻,，標(biāo)好細(xì)胞名稱、代數(shù),、復(fù)蘇日期,，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中,。一般貼壁細(xì)胞過(guò)夜即可貼壁,，換液和傳代時(shí)間根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。
細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)
?復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快,，盡量減少胞內(nèi)形成冰晶,，影響復(fù)蘇后細(xì)胞活率。
? 融化時(shí)盡量不要碰到管口,，以免容易造成污染,。
?若一次性需要復(fù)蘇細(xì)胞很多，可以分批水浴解凍,，防止傳熱不佳使得細(xì)胞融化時(shí)間延長(zhǎng),。
?若需要同時(shí)復(fù)蘇好幾種細(xì)胞，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記,，或記住自己擺放的位置,，不要弄混亂。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 懸浮細(xì)胞傳代
待培養(yǎng)液中酚紅指示劑變黃,，在已紫外滅菌后的超凈臺(tái)上吸出或倒出細(xì)胞懸液至離心管中(根據(jù)細(xì)胞液的量選擇15ml或50ml離心管),，800-1000rpm下離心5min，棄去營(yíng)養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)液,，加預(yù)熱好的*培養(yǎng)液適量,，輕輕吹打重懸細(xì)胞后，吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，或直接取適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,，再補(bǔ)加一定量新鮮*培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，有些脆弱的細(xì)胞用自然沉降法沉降細(xì)胞,，吸去上面舊培養(yǎng)液加入新的*培養(yǎng)液后吹散進(jìn)行傳代,。傳代接種的細(xì)胞密度根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定,，一般間隔1-2天即可傳代一次。
2. 貼壁細(xì)胞傳代
待培養(yǎng)瓶底中細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%-80%時(shí),，在經(jīng)紫外滅菌后的超凈臺(tái)上,，棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)菌1*PBS洗滌瓶底細(xì)胞1-2次,，用1ml(T25培養(yǎng)瓶)或2ml(T75培養(yǎng)瓶)trypsin溶液37℃下作用細(xì)胞,，待顯微鏡下細(xì)胞回縮變圓，少部分細(xì)胞出現(xiàn)流沙狀時(shí),，快速吸去trypsin溶液,，加預(yù)熱好的新鮮*培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞脫落且分散均勻,，直接吸取適量細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中,，或800-1000rpm下離心去上清，加適量新鮮*培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞,，然后轉(zhuǎn)移適量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中,，再加入一定量*培養(yǎng)液，搖勻瓶底細(xì)胞液后進(jìn)行培養(yǎng),。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)注意事項(xiàng)
? 吹打時(shí)每次不要排完移液管中液體,，同時(shí)控制吹打節(jié)奏，這樣不容易吹出泡沫,，泡沫對(duì)細(xì)胞有損傷作用,，而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒(méi)有*吧細(xì)胞吹打下來(lái)。
?不要等到貼壁細(xì)胞*鋪滿瓶底,，要留有一定空隙時(shí)細(xì)胞狀態(tài)才良好,。
?消化時(shí)最好不要等到細(xì)胞成片飄起，否則細(xì)胞狀態(tài)受影響且第二天培養(yǎng)中死細(xì)胞較多,。
細(xì)胞凍存
凍存的細(xì)胞要處在指數(shù)生長(zhǎng)期。懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞經(jīng)離心后用凍存液重懸,，計(jì)數(shù),，凍存的細(xì)胞密度一般3*106-1*107 cells/ml，最好不少于1*106 cells/ml,，否則復(fù)蘇后難以養(yǎng)起來(lái),，將重懸計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中，迅速擰緊蓋子,，放入梯度凍存盒然后置于-80℃過(guò)夜,，也可以先4℃放置30分鐘，再-20℃放置1-2小時(shí),，最后-80℃過(guò)夜(16-18小時(shí)),，若梯度凍存盒不夠或無(wú)凍存盒,，可以將凍存管置于泡沫盒中，用棉花包起來(lái),，棉花厚度約1cm,，置于-80℃過(guò)夜，第二天取出-80℃細(xì)胞存放至液氮罐中,，并在記錄好存放位置信息,。
凍存準(zhǔn)備
●配制好凍存液。一般凍存液為培養(yǎng)液,，血清,，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制,，不管哪種凍存液配制,，血清多多益善，但DMSO都不可以多,，以免對(duì)細(xì)胞造成損傷,。
●準(zhǔn)備好凍存管，標(biāo)上細(xì)胞名稱,，代次,，凍存批號(hào)，凍存日期,。
●準(zhǔn)備好細(xì)胞程序降溫盒或凍存用的材料,，程序降溫盒放置室溫后使用。
細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)
?程序降溫盒有無(wú)需有毒異丙醇填充的,，有利于實(shí)驗(yàn)人員身體健康,。
?DMSO有毒且皮膚會(huì)吸收，做好防護(hù)措施,。DMSO本身不長(zhǎng)菌,，不需要做滅菌處理。
?由-80℃轉(zhuǎn)至液氮時(shí)迅速,，避免溫度上升影響細(xì)胞活性,。
?每個(gè)凍存管不要加入體積太多，以免凍存時(shí)凝固體積膨脹,，撐開(kāi)凍存管,，且在下次復(fù)蘇時(shí)，融化較慢,，導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞存活率不高,。
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