聽老師將講HPLC的計算

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HPLC中涉及到計算的,，主要是流動相配制和含量計算,。RP-HPLC一般用緩沖鹽配合甲醇乙腈作為流動相，計算主要涉及到如何配制流動相的問題,。同時還要考慮到流動相配制的數(shù)量問題,。HPLC計算主要運用外標(biāo)法,。內(nèi)標(biāo)法在HPLC分析中，運用不多,。所以略講,。

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1、流動相配制的計算

流動相在HPLC中起到運輸樣品的作用,。而流動相準(zhǔn)確地配制,，在HPLC測試中有著重要的作用。準(zhǔn)確地配制流動相能夠保證測試中保留時間的重復(fù)性,。所以,，配制起來不能掉以輕心。

對于流動相配制,，我把它概括為以下幾個字,。

計算，稱量,，溶解,，調(diào)節(jié)，<混合>,，過濾,，脫氣。為什么我把“混合”外加了個框呢,？這就是涉及到你的設(shè)備是否是單元泵還是多元泵的問題了,。如果只有一臺單元泵，也無電磁閥切換功能的泵,，需要混合這個步驟,，而多元泵，或者低壓梯度切換的,，可以不需要所謂的混合,。各走各的。

打個比方說,，如果我的流動相是：甲醇：純水=60：40（v/v），對于單元泵,，那么只能甲醇和純水混合,，作為流動相，而多元泵或者多元梯度泵,，則可以有兩路,，A路放甲醇， B路放純水,，A與B各比例控制為60%,，和40%,。

對于HPLC 配制流動相，要保證流動性配制準(zhǔn)確,，也要保證流動相配制足量,，不多不少，這樣保證在這批測試中,，流動相不至于不夠,，也不致于太多而浪費，流動相一般需要在2-3天內(nèi)用完,。那么首先確定流動相要配制多少,。舉一個例子。

例

要分析30個樣品,，10個對照品,，樣品和對照品都分析2次。一個試樣分析20分鐘,，流速為1.2ml/min,。那么我要配制多少ml的流動相呢？通過計算來解決,。（注：自動進(jìn)樣,，連夜分析，可以設(shè)置停止泵程序）

一般來說,，試樣設(shè)置20分鐘,，還需要考慮進(jìn)樣的時間。假設(shè)進(jìn)樣時間為三分鐘,，那么一個試樣所需要的時間為23分鐘,。我們可以計算：

根據(jù)計算，需要配制2208ml流動相,。對于流動相,，我們不能配制得太摳，需要考慮到吸濾頭占的空間,，那么我們再多配制個100-300ml,，這取決于你的瓶底胖瘦。能夠保證不被吸空為宜,。那么我們就配制2500ml吧,。

對于流動相如何配制，我們給一個實例

比如我要測試中藥一清膠囊,，我們翻閱中國藥典,，得以下信息。

一清顆粒是由黃連，大黃,，黃芩（qin）組成,。一般用于清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血,。用于火毒血熱所導(dǎo)致的身熱煩躁,，目赤口瘡，咽喉牙齦腫痛,，大便秘結(jié),，吐血，咯血咽喉炎,，扁桃體炎,，牙齦炎等上述癥候者。

其中黃芩主要成分黃芩苷用HPLC方法測試,。先摘入如下：

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,，以甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)為流動相，檢測波長為275nm,。有效塔板數(shù)按黃芩苷峰計算不低于5000

我們看到,，其流動相是：甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)，那么也就是說有水相識0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液,，其pH=2.7（用磷酸調(diào)節(jié)）,，有機(jī)相是甲醇。

要注意,，對于HPLC用的試劑,，水，溶劑,，都是需要好的,。試劑一般在分析純以上。最好用優(yōu)級純,，溶劑一般用HPLC級別,。水用超純水。所有的溶劑,，溶液,，都需要用0.45微米（或更細(xì)）的微孔濾膜濾過。也要保證溶劑瓶清洗干凈,。干燥,。

流動相脫氣是很重要的，現(xiàn)在一般的儀器都有在線脫氣,。當(dāng)然，在配制流動相前脫氣,，亦重要,。一般脫氣又抽真空脫氣,，超聲波脫氣，吹He脫氣,，加熱回流脫氣等,。常用的是前兩個脫氣方法。當(dāng)然,，抽真空脫氣效率比較高,，但是要注意有機(jī)相是否在抽真空后比例改變的問題。所以,，對于混合兩相的流動相,，最好單獨濾過，再混合,?；旌虾笠话銜a(chǎn)生氣體，用效率略低的超聲波脫氣即可,。超聲波脫氣,，只要看到無明顯氣泡即可使用。

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二．含量計算

對于HPLC,，我們一般使用外標(biāo)法計算,。那么有同學(xué)問，那么為什么內(nèi)標(biāo)法很少在HPLC上使用呢?

那么我們看下氣相色譜和HPLC不同的進(jìn)樣方式,。GC手動進(jìn)樣還是依靠進(jìn)樣針的定量進(jìn)樣,，因為進(jìn)樣量很少，以微升計,，所以,，稍稍不留神，就有可能多進(jìn)或者少進(jìn)樣,。而且,，進(jìn)樣針上的刻度也很粗，所以,，GC用手動進(jìn)樣,，使用外標(biāo)法確實很考驗測試者的嫻熟技巧和過人的眼力。而內(nèi)標(biāo)法在GC進(jìn)樣測試中,，由于內(nèi)標(biāo)物的調(diào)節(jié)作用,，可以使得由于進(jìn)樣誤差降低到最小，其相關(guān)的文章,，查閱qinqingcao在本論壇的文章,。但是HPLC進(jìn)樣是六通閥進(jìn)樣，其有一根定量環(huán)，如果手動進(jìn)樣能夠保證定量環(huán)是充滿樣品溶液的,，那么進(jìn)樣誤差就幾乎不存在,。況且內(nèi)標(biāo)法需要尋找合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，同時配制內(nèi)標(biāo)物,，比較麻煩,，所以在HPLC中很少聽說用內(nèi)標(biāo)法定量計算。更多的,，是使用外標(biāo)法計算,。

所以，HPLC手動進(jìn)樣一般使用3倍量的定量環(huán)進(jìn)樣,。也就是說,，20微升的定量環(huán)，我要注入60微升以上的樣品溶液,。保證定量環(huán)中充滿著樣品溶液,。而多余的樣品溶液會被排除。這樣保證每次進(jìn)樣都是定量環(huán)中的那些量,。對于定量環(huán),，這個體積一般也不是正好是20.00微升，但是我們保證進(jìn)樣過量（多余的溶液會被排出）,，則能夠保證進(jìn)樣都是按照定量環(huán)中的體積進(jìn)入色譜系統(tǒng),，這樣消除進(jìn)樣的誤差。對于定量環(huán),，在做完樣品后需要用無溶質(zhì)的流動相清洗數(shù)遍,。如果定量環(huán)真的很臟，無法清洗了,，那么可以裁剪一段管徑和定量環(huán)相同的干凈的不銹鋼管,，裁剪長度和定量管相同，安裝上去,。當(dāng)然資金充裕的話,，也可以購買廠家的定量環(huán)。

當(dāng)然現(xiàn)在自動進(jìn)樣器很普及,，那么使用自動進(jìn)樣器就更加方便了,。

對于外標(biāo)法，實際上也就是用已知濃度的對照品（標(biāo)準(zhǔn)品）來對樣品中的該物質(zhì),。這實際上很象砝碼和天平,。標(biāo)準(zhǔn)品就如同砝碼，在同樣的色譜條件下,，標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和濃度已知,，而樣品中的峰面積可以測試出來,，這樣通過比例式子比較出樣品中該物質(zhì)的濃度了。

在這里,，我想和大家說明的是,，一般是通過保留時間做定性的。比方說,，我測試維生素C，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品在一定的色譜條件下,，其保留時間為2.4分鐘,；樣品在同樣的色譜條件下，2.4分鐘有峰,，一般認(rèn)為是樣品中也許有維生素C,。當(dāng)然，保留時間定性確實有其局限,，但是沒有其他手段,，那么保留時間還是能夠發(fā)揮定性的作用。

對于定量,，外標(biāo)法定量,，如果做的準(zhǔn)確的話，需要用多點（濃度）定量,。然而在企業(yè)用單點法定量還是很多的,。對于做線性，精密度,，回收率,，這些內(nèi)容我們在方法學(xué)驗證中講授，這里我還是著重講解單點法校正,。

在講單點法校正,，我先問同學(xué)們一個問題，如何用簡單的方法來測試校園中的樹高度,？

通過一根已知高度的biao桿,，在太陽下投射在地面的陰影的長度，計算出樹的高度,。同樣道理,，我們也是用已知的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積，用樣品中同一物質(zhì)的面積,，計算出樣品中的那個物質(zhì)的濃度,。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出樣品中，該物質(zhì)的含量,。

如果與標(biāo)準(zhǔn)曲線聯(lián)系起來,，這個就是單點法,。也就是說，以0為圓心,，標(biāo)準(zhǔn)品濃度和面積在二元坐標(biāo)的一點的連線作為校準(zhǔn)曲線,。得y=ax 其中的a就是斜率，也就是面積隨著濃度的變化而變化,，其變化率為a,。

那么樣品濃度的計算，就是按照其峰面積在坐標(biāo)上的點,，對應(yīng)的濃度,。用以下公式計算。

單點法：

我們給出一個例題,。

例

測試果汁中維生素C含量,。配制20mg/100ml的維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)品。稱取20.005g果汁到50ml容量瓶中,，加入流動相溶解定容搖勻,。濾紙過濾。吸取濾液10ml到50ml容量瓶中,。流動相定容搖勻,。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均吸取20μl進(jìn)色譜，分別得到峰面積24336（標(biāo)準(zhǔn)品）,，20129（樣品）,。計算果汁中維生素C含量（mg/100g）

                                                                                                                                       本篇轉(zhuǎn)載至液相色譜之家