國(guó)產(chǎn)超濾離心管如何使用,?

國(guó)產(chǎn)超濾離心管如何使用?
【問(wèn)】:超濾離心管想重復(fù)使用,,請(qǐng)問(wèn)如何清洗和保存,?
最近使用超濾管,由于管子較貴,,想重復(fù)用幾次,,但找不到可靠的資料。不知如何清洗和保存,,比如有人說(shuō)用DIE氮化鈉,,有人說(shuō)用氫氧化鈉,有人說(shuō)用乙醇浸泡,。莫衷一是,。很急用。
【回答精要】
使用后用0.1M NaOH泡24h,,然后20%乙醇浸泡保存,。
這個(gè)我是聽(tīng)老板們說(shuō)的,的確乙醇泡完后孔徑會(huì)增大,,基本就是5-10KD,,也就是說(shuō)如果你的蛋白在21KD以上,應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題,?;蛘呖梢圆挥靡掖寂荩肗aOH洗之后直接用無(wú)菌水保存,,每周換一下液體,,應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題。
看看說(shuō)明書(shū)不就結(jié)了,!我原來(lái)在CRO的時(shí)候一直是重復(fù)用的,,也沒(méi)見(jiàn)什么不好啊!短期會(huì)用的話,,用20%的乙醇泡著,,回頭拼命用millipore(其他可以替換的水也可以)的水充干凈,然后在用樣品緩沖液平衡一下就好,,至于有些人說(shuō)的改變孔徑,,也沒(méi)那么大影響的,你至少跟目的蛋白分子量差別3倍的截留分子量才安全的不是嗎?1個(gè)月以?xún)?nèi)不用的話,,建議用100mM的NaOH保存,!更長(zhǎng)時(shí)間的話加0.02%的疊氮鈉,但那個(gè)東西強(qiáng)致癌物,,不建議使用,。
理論上截留目標(biāo)物,孔徑應(yīng)選1/3~1/5的膜,;透過(guò)目標(biāo)物,,孔徑應(yīng)選5-10倍的膜。
【問(wèn)】準(zhǔn)備用超濾離心管從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中濃縮蛋白,,在園子里找到一些關(guān)于濃縮蛋白的一些帖子,,但還有些問(wèn)題還是向園子里的大蝦請(qǐng)教一下。我們定的是Amicon Ultra 15ml(其他如果確定可以替換的也可以)規(guī)格的管子,,不知道有沒(méi)有誰(shuí)以前做過(guò)的,,有關(guān)于轉(zhuǎn)速,時(shí)間給一些建議,,另外細(xì)胞上清液離心前是否需要什么預(yù)處理,?離心之后回收蛋白時(shí)怎么盡量減少損失?如果要把管子重復(fù)利用,,NaoH清洗后,,如何在20%的乙醇中保存?是將其浸到乙醇中防于4度,,還是在管子中灌入乙醇?
【回答精要】
我用過(guò)5ml的管子,,當(dāng)時(shí)使用的轉(zhuǎn)速是4000rpm 8min,,可以把5ml的樣品液濃縮到約200ul,這僅供參考,,具體情況還要由您的樣品決定,。
我保存5ml管子的方法是把內(nèi)管取出,浸泡于裝有20%乙醇的燒杯中,。四度保存,。
該種管子可以脫鹽濃縮但不宜根據(jù)截留半徑做分離蛋白用。
我用的是3500g,4度離心,,時(shí)間可以自己控制,,取決于你最終的濃縮體積,我一般是200ul左右,。
千萬(wàn)別一下離心時(shí)間太長(zhǎng),,不同的蛋白濃縮的速度不同,有的需要長(zhǎng)時(shí)間離心,,有的則一下子就好,。當(dāng)然也和你的蛋白是否比較純,所用的是什么buffer,,還有蛋白的濃度有關(guān)系,。所以離心時(shí)要先短些時(shí)間觀察一下你的濃縮速度,不要一下子濃縮過(guò)了,,甚至形成沉淀就得不償失了,。
另外其實(shí)他們的管子都設(shè)計(jì)的是一次性使用,所以如果想重復(fù)使用,,不要離得速度太高,,4000-4500RPM就差不多了,另外重復(fù)使用時(shí)要看看管壁上有沒(méi)有裂紋,,現(xiàn)在的管子好像不如從前的結(jié)實(shí)了,。
用后把管子用純水洗干凈,離心少時(shí),,洗一下膜,,再象propeg主任說(shuō)的那樣收起來(lái)即可。使用多次后若覺(jué)得有些堵,,就可以用NaOH泡泡,,離心幾分鐘,應(yīng)該會(huì)有改善,。
純化多肽,,截?cái)喾肿恿靠梢赃x10倍,純化球蛋白,,截?cái)喾肿恿靠梢赃x3倍,,如管子要重復(fù)使用,轉(zhuǎn)速設(shè)轉(zhuǎn)速(G)的80%左右,,不然時(shí)間長(zhǎng)了塑料就裂了,,膜也容易出問(wèn)題。
離心后管子用MilliQ水清洗干凈,,浸泡在水中,,4度保存就行了,不放心就放點(diǎn)防腐劑,但是這個(gè)管今后只能用來(lái)離心同類(lèi)的樣品哦,。
超濾損失蛋白是正常的,,樣品體積大就分批離心,別搞的離心時(shí)間太長(zhǎng),,樣品里的雜質(zhì)如果可能盡量在離心前去除一些,。
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