COIP免疫共沉淀實驗原理

COIP免疫共沉淀實驗原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法,。這是確定兩種蛋白質在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時,，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用就被保留了下來,。假如用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結合的蛋白質Y也能沉淀下來,。目前多用精制的proreinA預先結合固化在argarose的beads上,，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的proreinA就可以吸附抗原達到精制的目的,。這樣的方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內(nèi)結合,；也可用來確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

COIP免疫共沉淀的優(yōu)點

其優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的,，處于天然狀態(tài),；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響,；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物,。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,，而可能有第三者在中間起橋梁作用,；（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以,，若預測不正確,，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性,。

COIP免疫共沉淀注意事項

(1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質一蛋白質相互作用，

多采用非離子變性劑(NP40 或Triton X-100),。 每種細胞的裂解條件是不一-樣的,，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),， 細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,，如商品化的

cocktailer。

(2)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,，而并非外源非特異蛋白,，單克隆抗

體的使用有助于避免污染的發(fā)生;.

(3)要確保抗體的特異性,，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;

(4)確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的,，這需要進

行蛋白質的定位來確定,。