超濾離心管使用的注意事項

離心管就是一個簡單的可以承受高轉速壓力的管子,，比如離一些樣品,，分離出上清沉淀。 蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,，目前常用的就是Millipore的,。目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定,?？芍貜褪褂茫褂靡淮尉腿拥籼速M,。

離心超濾管會有一個類似于內管和外管的兩個部分,，內管中是帶有一定分子量的膜，當高速離心時,，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了,，分子量比它大的就截留在上面(即內管中)，就是超濾的原理,。超濾離心管的選擇主要看你要截留那部分物質,，就選擇比最小分子量小的，如果你要截留26KD的,，你要的超濾管就要比26小,。但兩者也要有一定的差距，比如，選擇20-25KD之間的就不合適,，因為26的也可能會出去(這是由制造工藝決定的),。所以選擇20KD以下的超濾管比較合適。

以下是給大家總結的超濾離心管使用的注意事項,。

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選擇合適的超濾管,，主要考慮MWCO和濃縮體積，常見的是10kD,。到底選擇多大截留分子量比較合適呢?10kDa,、 5kDa、還是30kDa?通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同,，表格中有,。

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新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水,，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準,。操作要輕,，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷,。

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平衡,。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾(離心機預冷至4度),。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后,，有所不同。具體可參閱附件里的說明書,。離心機的加速度調至低檔,，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機達到目的轉速之后,，方可離開離心機,，否則離心機出問題時，無法馬上處理,，后果不可預測!膜與轉軸的方向根據(jù)說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直),。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命,。

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當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液,，加入10ul流穿,，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,，用5mg/ml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導致堵管。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的Buffer,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。

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前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾),，再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，末次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內的情況,。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上,，基本上可以達到換buffer的目的,。

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取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭(200ul)取,，輕輕順著邊緣插入槍頭,，輕輕吹打、混勻蛋白液,，注意不要碰到超濾膜,，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul,，直到吸完,。管底剩下的一點濃縮液不必吸取，否則難度太大,，有可能損壞超濾膜,。最后加入MilliQ水到超濾管中，沒過 超濾膜,，防止膜失水變干,。

以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟,。

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倒出超濾管里的水,，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉淀,，可以先加入水,，然后用槍頭吹打，注意不要碰到膜,，吹打至沉淀懸起,，然后倒掉，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液,，室溫放置20min,，期間平衡超濾管。再離心10min,。倒出殘留的NaOH溶液,，將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度,。50ml管和蓋子用自來水洗,，內壁再用 MilliQ水洗干凈。

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取出浸沒的管芯,，加至接近滿的MilliQ水,，50ml管也加滿MilliQ水,，將管芯慢慢放入50ml離心管,，排出部分水,，然后蓋上蓋子，放4度保存,，直到下次使用,。一般來說，按照上述步驟和注意事項,，每根管用三四年不會壞,。

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