蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）,。也有其它型號(hào)的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積,、濃縮目標(biāo)體積而定?？芍貜?fù)使用,。

1、選擇合適的超濾管,，主要考慮MWCO和濃縮體積,，通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。

2,、新買(mǎi)來(lái)的超濾是干燥的,，使用前加入MilliQ水，水量*過(guò)膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘,。然后將水倒出，即可加入蛋白液,，加入的多少,，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

3,、平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜,。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實(shí)際使用中,，一般轉(zhuǎn)速開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。

4,、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國(guó)產(chǎn)Bradford溶液,，加入10ul流穿,，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要精確判斷是否漏管,，用5mg/ml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)】,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱），直到濃縮液都加完為止,。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管,。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的Buffer,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。

超濾管

5,、前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次,，濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的,。

6、取出蛋白濃縮液的操作在冰上操作,，用黃槍頭（200ul）取,，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打,、混勻蛋白液,，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液,，每次吸接近200ul,，直到吸完。管底剩下的一點(diǎn)濃縮液不必吸取,，否則難度太大,，有可能損壞超濾膜。加入MilliQ水到超濾管中,，沒(méi)過(guò)超濾膜,，防止膜失水變干。

離心超濾管

7,、以下是處理超濾管,，重復(fù)利用超濾管的步驟,。

8、倒出超濾管里的水,，用milliQ水輕輕潤(rùn)洗幾次,，【若管底有可見(jiàn)的蛋白沉淀，可以先加入水,，然后用槍頭吹打,，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起,，然后倒掉,，不可用自來(lái)水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min,，期間平衡超濾管,。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液,，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí),，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來(lái)水洗,，內(nèi)壁再用MilliQ水洗干凈,。

9、取出浸沒(méi)的管芯,，加至接近滿的MilliQ水,，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml

離心管,，排出部分水,，然后蓋上蓋子，放4度保存,，直到下次使用,。一般來(lái)說(shuō)，按照上述步驟和注意事項(xiàng),，每根管用三四年不會(huì)壞,。

上海登寧科技有限公司產(chǎn)品包括各類(lèi)濾紙、濾膜,、濾器以及輔助器材,，普遍應(yīng)用于生命科學(xué)，農(nóng)業(yè),，藥物醫(yī)學(xué),，化工，食品，水質(zhì)分析,，環(huán)境監(jiān)測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域,，公司與各廠家建立了穩(wěn)定的合作關(guān)系，確保正貨的同時(shí)更可以滿足客戶對(duì)于便捷和實(shí)惠的需求,。