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利用層析柱將混合物各組分分離開(kāi)來(lái)的操作過(guò)程稱為柱層析。柱層析是層析技術(shù)中的一類，依據(jù)其作用原理又可分為吸附柱層析(原理見(jiàn)第97～100頁(yè)和第101～102頁(yè)),、分配柱層析(原理見(jiàn)第91～92及94～95頁(yè))和離子交換柱層析等。其中以吸附柱層析應(yīng)用**廣,。以下只介紹吸附柱層析的相關(guān)問(wèn)題,，其操作方法也可作為其他類型柱層析的參考,。
1.吸附柱層析的器材(1)層析柱
實(shí)驗(yàn)室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管,，如圖3-3**所示,，活塞的芯**好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂,，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞,，則真空油脂要小心地涂薄涂勻,。另一種是將玻璃管下端拉細(xì)，套上一段彈性良好的管子,。這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的,，普通橡皮管一般不可充作此用,，因?yàn)橄鹌ひ妆宦确隆⒈?、THF等溶劑溶脹,，而聚乙烯管子對(duì)大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用,。用一只螺旋夾控制流速,，如圖3-35b所示。此外,，薄膜塑料柱如圖3-35c,，因使用方便、節(jié)省淋洗劑,、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點(diǎn),，應(yīng)用日趨廣泛。薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的,，兩側(cè)常有很深的折痕,。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊,。將這段玻璃管穿過(guò)一個(gè)單孔塞,。然后將薄膜管放進(jìn)一根又粗又長(zhǎng)，下端拉細(xì)了的玻璃管內(nèi),，使塞子塞緊大玻璃管的口,。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部而自行展圓,。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個(gè)小孔即可使用,。
層析柱的尺寸根據(jù)被分離物的量來(lái)確定，其直徑與高度之比則根據(jù)被分離混合物的分離難易而定,，一般在1∶8到1∶50之間,。柱身細(xì)長(zhǎng)，分離效果好,，但可分離的量小,，且分離所需時(shí)間長(zhǎng)；柱身短粗,，分離效果較差,，但一次可以分離較多的樣品，且所需時(shí)間短,。如果待分離物各組分較難分離,，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子，如果要處理大量的較易分離的或?qū)Ψ蛛x純度要求較低的混合物,，則可選用粗而短的柱子,。**常使用的層析柱,，直徑與長(zhǎng)度之比在1∶8到1∶15之間。
(2)吸附劑
柱層析中**常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠,。其用量為被分離樣品的30～50倍,，對(duì)于難以分離的混合物，吸附劑的用量可達(dá)100倍或更高,。對(duì)于吸附劑應(yīng)綜合考慮其種類,、酸堿性、粒度及活性等因素,，**后用實(shí)驗(yàn)方法選擇和確定,。市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分,。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后,，用蒸餾水洗到其浸出液的pH值為4，適用于分離酸性物質(zhì),；堿性氧化鋁浸出液的pH值為9～10,，用以分離胺類、生物堿及其他有機(jī)堿性化合物,。中性氧化鋁的相應(yīng)pH值為7.5,，適合于醛,、酮,、醌、酯等類化合物的分離以及對(duì)酸,、堿敏感的其他類型化合物的分離,。硅膠沒(méi)有酸堿性之分，可適用于各類有機(jī)物的分離,。柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100～150目,，硅膠為60～100目，如果顆粒太小,，淋洗劑在其中流動(dòng)太慢,，甚**流不出來(lái)。
氧化鋁和硅膠的活性各分五個(gè)等級(jí)(見(jiàn)表2-5),。哪個(gè)活性級(jí)別分離效果**好,，要用實(shí)驗(yàn)方法確定，而不是盲目選擇高的活性級(jí)別,，**常使用的是Ⅱ～Ⅲ級(jí),。如果吸附劑活性太低，分離效果不好,，可通過(guò)“活化”來(lái)提高其活性,。所謂“活化”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過(guò)程,。通常是將吸附劑裝在瓷盤里放進(jìn)烘箱中恒溫加熱,。“活化”的溫度和時(shí)間應(yīng)根據(jù)分離需要而定。氧化鋁一般在200℃恒溫4h,，硅膠在105～110℃恒溫0.5～1h,。“活化”完畢，切斷電源,，待溫度降**接近室溫時(shí)，從烘箱中取出放進(jìn)干燥器中備用,。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好,，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些,。
此外,，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團(tuán),，對(duì)微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素,、淀粉或糖類作吸附劑,。活性碳是一種吸附能力很高的吸附劑,，但因粒度太小而不常用,。
(3)淋洗劑
淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來(lái)所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡(jiǎn)稱溶劑,。其極性大小和對(duì)被分離物各組分的溶解度大小對(duì)于分離效果非常重要,。如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強(qiáng)烈吸附,，從而將原來(lái)被吸附的待分離物“頂替”下來(lái),，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)小于各組分的極性,，則各組分被吸附劑強(qiáng)烈吸附而留在固定相中,，不能隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，也不能達(dá)到分離的目的,。如果淋洗劑對(duì)于被分離物各組分溶解度太大,，被分離物將會(huì)過(guò)多、過(guò)快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離,；如果溶解度太小,，則會(huì)造成譜帶分散，甚***不能分開(kāi),。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同,，第99～100頁(yè)給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序,，可作為選擇溶劑的參考,，首先在薄層層析板上試選(見(jiàn)圖3-40)，初步確定后再上柱分離,。如果所有色帶都行進(jìn)甚慢則應(yīng)改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑,，直**獲得滿意的分離效果,。
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