對于養(yǎng)細胞的人來說

可謂是談“污”色變

每次養(yǎng)細胞總讓人精神錯亂

打開培養(yǎng)皿的那一刻

連呼吸都是如此多余

只要有任何的異樣

無論是支原體還是雜菌

污染/污染/污染

猶如細胞實驗的魔宙

讓一切都無限重復(fù)

那么如何將失敗率降到更低,，讓我們擺脫玄學(xué)的定律呢,？

今天專門為大家盤點了細胞培養(yǎng)超實用干貨

細菌污染最為常見,，一旦操作稍有不當(dāng),，就會引起細胞污染，細菌污染后顯微鏡下觀察呈現(xiàn)有黑色細條沙狀,，當(dāng)然,，根據(jù)感染的細菌不同，所呈現(xiàn)的狀態(tài)也不盡相同,，有球形,、桿狀等，其次,，培養(yǎng)液發(fā)黃,，變渾濁，可明顯看見培養(yǎng)皿中有細沙狀的沉淀物,，時不時還有異樣氣味發(fā)出,，如下圖所示：

處理方法：

　　在培養(yǎng)基中加入抗生素處理，可以用四環(huán)素,，慶大霉素,，或者鏈霉素，前兩者的工作濃度是50 μg/mL;鏈霉素的工作濃度是100 μg/mL,。但是,，細胞本身也有影響，狀態(tài)大不如從前,，所以,，防范于未然，正確操作,、嚴格執(zhí)行無菌操作規(guī)范,，定期清理消毒培養(yǎng)設(shè)施才是關(guān)鍵!
二、真菌污染

　　真菌污染培養(yǎng)液清亮透明,，不會像細菌感染大爆發(fā),，所以很難早期發(fā)現(xiàn)，鏡下有時候象絲狀，有時候象珊瑚狀,，慢慢地會長出很細的黑色絲狀物,，這個時候，已經(jīng)晚了,，細胞很難救活了,。

處理方法：趕緊扔掉，不要再想挽救,，即使再珍貴,。然后*消毒滅菌培養(yǎng)間，CO2孵箱,，器皿和培養(yǎng)液,。

三、霉菌污染

　　同真菌感染一致,，因為培養(yǎng)液是清亮的,，所以霉菌污染早期難以發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)為時過晚了,。培養(yǎng)液中慢慢地出現(xiàn)絮狀雜質(zhì),，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，如同風(fēng)中柳絮,，一般不仔細看發(fā)覺不出來,。細胞仍可生長，但時間一長,，細胞的狀態(tài)就變差,，不再增長。見下圖,。

　　處理方法：建議果斷舍棄該污染細胞,，將環(huán)境*消毒，因為霉菌的頑固可能會導(dǎo)致下幾批細胞都會污染,，所以,，采用酒精*底地擦洗一遍CO2孵箱。然后再用新潔爾滅擦洗一遍,，把水盤里加上飽和量的硫酸銅,。千萬不可大意

四,、支原體感染

　　培養(yǎng)液變渾濁,，支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯,，只是細胞狀態(tài)變差,、生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁,。細胞傳代以后就出現(xiàn)細胞間黑點,，細胞空泡化，很多類似凋亡,、壞死的細胞,，最終細胞漂浮，*死亡,。

處理方法：

　　如果不是很珍貴的細胞的話,，建議直接扔了吧。

五,、黑膠蟲污染

開始污染時對細胞無影響,，當(dāng)數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產(chǎn)生影響。400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體,，培養(yǎng)液也是不渾的,，一般不會太影響，細胞還是可以用的,。常常是細胞生長狀態(tài)良好,，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色,、透明度無明顯變化,，對細胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會自然消失,，除更換血清外無須特殊處理,。

　　處理方法：可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率,，盡早處理細胞,，越快越好。

根據(jù)細胞生長特性的不同,，傳代可分為懸浮細胞傳代和貼壁細胞傳代兩種類型，對于懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進行傳代,，或用離心法后,，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進行傳代；貼壁生長的細胞則用消化法進行傳代,，下面我們介紹傳代培養(yǎng)的一些注意事項,；

一、貼壁細胞傳代如何使用胰酶,？

一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na,。

消化液濃度過高時,，易造成培養(yǎng)基中細胞碎片增多，黑渣子增多,，常規(guī)細胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化,，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進行消化，細胞密度過高超過80%時,，采用分步消化法,。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進行,，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,，保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低,，并可減少污染之機會,。

二、如何控制胰酶消化時間,？

胰酶消化的程度是細胞培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵步驟：消化過度細胞碎片增多,，黑渣子增多，細胞會成片脫落,，嚴重影響細胞活性,，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失,；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下,，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性。

不同細胞對消化液的敏感性不同,，胰酶消化的時間也會有差異,。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA,，胰酶的儲存時間,，胰酶的儲存溫度，是否反復(fù)凍融,，消化加入的胰酶體積,，消化溫度及細胞的密度有關(guān)。消化對于新購買的細胞,，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時間,，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄最佳消化時間,，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可,。

三、細胞抱團怎么處理,？

一些懸浮細胞抱團生長是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細胞在細胞密度很高的情況下,，很可能會出現(xiàn)部分細胞抱團生長的現(xiàn)象,，聚團細胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細胞,，因此在培養(yǎng)懸浮細胞時需控制好細胞密度,。如果出現(xiàn)了細胞團，可以通過細胞篩去掉部分較大的細胞團,，也可以嘗試一下方法：將細胞懸液收集到15 ml離心管中,，靜置20 min左右，小心取上層細胞上清培養(yǎng)（該方法只能去除部分較大的細胞團）,。

四,、細胞內(nèi)有空泡，是否是正?，F(xiàn)象,？

部分細胞本身存在一定的空泡（如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等）,，這個是正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡,，則很可能是細胞狀態(tài)不佳,，可以通過調(diào)整血清濃度，控制消化,，控制傳代比例及時間等方法來調(diào)整細胞狀態(tài),；如果大部分細胞出現(xiàn)空泡，且單個細胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多,，則可能細胞代次較高,，細胞老化所致，需更換代次較早的細胞,。

五,、細胞生長逐漸變慢是什么原因？

細胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細胞營養(yǎng)不良 4.細胞頻繁傳代 5.細胞狀態(tài)不佳或老化 6.細胞存在污染,。

六,、細胞何時進行傳代較好？

一般情況下細胞生長至*匯合后就應(yīng)該傳代,，所有細胞生長都有一個要求不宜生長過密（也就是常說的長老了）,，但有接觸抑制的細胞，在匯合前就必須進行傳代,，這類細胞一般在密度70-80%就進行傳代,，否則會引起細胞分化,。

一,、復(fù)蘇

1）取出凍存管,，立即放入37度水浴箱中快速解凍（1分鐘左右），水面不可沒過蓋子,，以避免污染,。

2）將凍存管移至無菌操作內(nèi)。打開凍存管,，將細胞懸液吸到離心管中,，1000rpm, 5min，棄上清,。

3）加入適量*培養(yǎng)基,，置于37度恒溫箱中培養(yǎng)即可。

4）次日更換一次培養(yǎng)液,以去除任何殘留的冷凍保護劑,，繼續(xù)培養(yǎng),。

二、凍存

1）用無菌吸管吸棄瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基,；

2）加入少量 PBS 沖洗二遍,， 用胰蛋白酶把單層細胞消化下來，依據(jù)傳代的方法把細胞 懸液收集于離心管中,，離心 1000 rpm,，5-8 min； 

3）小心棄上清液,，加入配置好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后將含有 細胞的凍存液轉(zhuǎn)移到無菌的凍存管中,，每個凍存管加液 1-1.5 ml,，細胞最終密度為 （5—10）×106 /ml； 

4）凍存管封口,，做好標(biāo)記,，按照以下程序凍存：

第一種方法：標(biāo)準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；當(dāng)溫度達到-25℃以下時,，可增至-5℃~-10℃/min,；到-150℃時，則可迅速浸入液氮中,。

第二種方法：凍存管放入4℃,，約30 min,﹣20℃ 30min- 60 min，見細胞懸液結(jié)凍后,，放入﹣80 ℃冰箱,， 過夜后轉(zhuǎn)入于液氮罐中,。 

第三種方法：將凍存管放于程序降溫盒中，并置于-80℃冰箱4h以上,，轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存,。