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細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)污染原因及其預(yù)防
如何保持無(wú)菌,，是每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室一直面對(duì)的難題,。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術(shù)不嚴(yán)格，試劑質(zhì)量不達(dá)標(biāo),，大氣中孢子計(jì)數(shù)增加,，培養(yǎng)箱或操作臺(tái)使用和維護(hù)不當(dāng)，污染了的冰箱和水浴鍋,。因此,，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，操作者不僅要嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)的操作程序,，同時(shí)還要特別注意新產(chǎn)品,、新品牌、以及設(shè)備的清潔維護(hù),。
細(xì)胞作為重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷V泛應(yīng)用于各類(lèi)生物實(shí)驗(yàn),幾乎所有科研實(shí)驗(yàn)室中都需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最大的威脅就是細(xì)胞污染,凡是混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中,對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。細(xì)胞一旦遭到污染,所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)變得毫無(wú)意義,。因此,及時(shí)檢測(cè)并鑒定出所培養(yǎng)的細(xì)胞是否被污染至關(guān)重要,。
污染來(lái)源
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室要求保持無(wú)菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響,。細(xì)胞培養(yǎng)室要相對(duì)封閉,，潔凈無(wú)塵，設(shè)有緩沖間,。對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定期清掃,、紫外消毒是避免細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境引起細(xì)胞污染的主要措施，此外,，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不要放太多雜物,，保持實(shí)驗(yàn)室干燥，有利于降低因?qū)嶒?yàn)室條件引起的細(xì)胞污染率,。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員是否操作規(guī)范,，是否嚴(yán)格遵守?zé)o菌工作流程，是細(xì)胞污染的一個(gè)主要因素,。操作人員進(jìn)培養(yǎng)室前,，必須先洗手,，在緩沖間換穿專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服和拖鞋，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)頻繁出入培養(yǎng)室,。實(shí)驗(yàn)后應(yīng)將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢物和廢液及時(shí)清理出培養(yǎng)室,，并清潔無(wú)菌工作臺(tái)。
常見(jiàn)污染原因
1,、細(xì)菌,、真菌污染
細(xì)菌和真菌污染很容易被檢測(cè),因?yàn)槭艿郊?xì)菌、真菌污染的細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的明顯特征,。細(xì)菌污染會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,、顏色改變以及pH值急劇變化,受污染的貼壁細(xì)胞在幾天內(nèi)會(huì)逐漸脫壁死亡。真菌污染后的細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢,培養(yǎng)基中會(huì)漂浮白色,、淺黃色或黑色的小點(diǎn),。因此,通過(guò)觀察培養(yǎng)基的顏色、漂浮物,、pH值或在顯微鏡下觀察細(xì)胞及其生長(zhǎng)狀態(tài),從而能初步判斷該細(xì)胞是否受細(xì)菌,、真菌污染。也可以使用培養(yǎng)檢測(cè)法：將細(xì)胞培養(yǎng)物在各類(lèi)培養(yǎng)基中適溫培養(yǎng)若干天后,觀察是否有細(xì)菌或真菌生長(zhǎng),。
2,、支原體污染
支原體污染會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)、功能,、代謝,、細(xì)胞膜、生長(zhǎng)速率,、誘導(dǎo)染色體畸變,、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等各種細(xì)胞特性。受支原體污染的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的pH值不會(huì)發(fā)生改變,也不會(huì)渾濁,因此,很難直接觀察出細(xì)胞是否受到污染,。
常用的支原體檢測(cè)DNA熒光染色法：使用熒光染料DAPI或Hoechst33258染色,，熒光染料能選擇性的結(jié)合細(xì)胞和支原體DNA的小溝,因此,在準(zhǔn)備過(guò)程中,任何存在的DNA均會(huì)被染色。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后,細(xì)胞核外與細(xì)胞周?chē)煽吹皆S多大小均一的熒光點(diǎn),。
3,、霉菌污染
霉菌污染早期，應(yīng)用PBS多次沖洗細(xì)胞,，盡量將孢子洗掉,，然后用兩性霉素處理。兩性霉素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響也很大,，濃度過(guò)高可致細(xì)胞死亡,，濃度過(guò)低時(shí)則不能抑制霉菌生長(zhǎng)。
4、病毒污染
有關(guān)病毒污染的資料不多,，但一般認(rèn)為病毒污染不影響細(xì)胞培養(yǎng),，通過(guò)PCR技術(shù)可以檢測(cè)。不過(guò)病毒污染對(duì)生產(chǎn)疫苗是不安全的,。因此,，至今，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗,、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒,，現(xiàn)如今值得期待的是下游工藝中除病毒過(guò)濾器的開(kāi)發(fā),。
結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本人的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,，潛在的污染途徑主要包括操作技術(shù)和環(huán)境,，其中環(huán)境因素又包括了無(wú)菌試劑和材料、超凈工作臺(tái),、恒溫恒濕培養(yǎng)箱,、水浴鍋和冰箱等。
一,、操作技術(shù)
培養(yǎng)操作前——
?、艂€(gè)人衛(wèi)生：進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室時(shí)應(yīng)更換實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用鞋或者穿鞋套；穿戴實(shí)驗(yàn)服,、口罩和手套,，用消毒酒精（75%濃度的乙醇）擦拭雙手；如果操作者是長(zhǎng)發(fā),，應(yīng)扎于腦后,。
⑵工作臺(tái)準(zhǔn)備：提前0.5~1h打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈進(jìn)行消毒,；用蘸有消毒酒精的紙巾擦拭超凈臺(tái)的臺(tái)面,、擋板等。
?、窃噭?zhǔn)備：從冷藏室或冷凍室取出所需的培養(yǎng)基等試劑,，于37℃水浴鍋中進(jìn)行加熱；加熱后用消毒酒精擦拭瓶身,，并立馬放入超凈工作臺(tái)內(nèi),。
須注意的事項(xiàng)有：外套、書(shū)包等物品,，易附著豐富的微生物,，不應(yīng)帶入細(xì)胞房。
培養(yǎng)操作中——
⑴臺(tái)面布置：按實(shí)驗(yàn)需要和個(gè)人習(xí)慣,，合理放置試劑,、耗材、儀器等物品,；點(diǎn)燃酒精燈后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作,。
⑵操作：靠近火焰進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,；試劑瓶經(jīng)火焰旋轉(zhuǎn)灼燒后打開(kāi),；挑選吸管，快速的縱向在火焰上來(lái)回移動(dòng)并做180°旋轉(zhuǎn),；將試劑瓶向吸管傾斜,，吸出所需的液體量；灼燒瓶頸后,，重新蓋上蓋子,；等所有操作完畢后，擰緊瓶蓋,。
須注意的事項(xiàng)有：操作要準(zhǔn)確,、敏捷、有序,；吸取溶液時(shí),，應(yīng)專(zhuān)管專(zhuān)用，避免交叉污染,；吸管管口要向下傾斜,，以防止液體倒流進(jìn)入移液器內(nèi)發(fā)生污染；盡量減少細(xì)胞和培養(yǎng)基的敞口時(shí)間,；已開(kāi)口的試劑瓶盡可能的傾斜放置,，防止下落微生物的污染；避免在敞口的細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿蓋上方操作,；不要面對(duì)工作臺(tái)或細(xì)胞培養(yǎng)箱講話(huà)或咳嗽,，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發(fā)生污染；若發(fā)生外溢,，用蘸有消毒酒精的棉球及時(shí)擦去,。
培養(yǎng)操作后
⑴整理：將試劑放回原來(lái)的存儲(chǔ)位置,；整理工作臺(tái)面,，物歸原位，合理丟棄廢液和廢物,。
?、葡荆河孟揪凭潦门_(tái)面,；打開(kāi)超凈工作臺(tái)和細(xì)胞房的紫外燈，照射至少15min,。
須注意的事項(xiàng)有：紫外燈開(kāi)啟后,，人不能進(jìn)入，紫外線對(duì)眼睛和裸露的皮膚均有危害,，若要進(jìn)入,，一定要先關(guān)閉紫外燈，待人離開(kāi)后打開(kāi),。
二,、環(huán)境
如果操作者技術(shù)規(guī)范且操作嚴(yán)謹(jǐn)，那么當(dāng)環(huán)境惡化時(shí),，也會(huì)導(dǎo)致污染風(fēng)險(xiǎn)的增加,。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，環(huán)境必須潔凈,。
恒溫恒濕培養(yǎng)箱——細(xì)胞污染一個(gè)主要的途徑就是恒溫恒濕培養(yǎng)箱。恒溫恒濕培養(yǎng)箱,，在培養(yǎng)細(xì)胞取出和放入的過(guò)程中,，直接與空氣接觸，微生物會(huì)被夾帶進(jìn)入,；加之其內(nèi)部濕度高,、溫度適宜，特別有利于真菌繁殖,。細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,，如果接觸了操作臺(tái)以外的地方，在放入培養(yǎng)箱前須經(jīng)消毒酒精擦拭,。但須注意的是,，消毒酒精要經(jīng)操作臺(tái)吹干，否則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)箱內(nèi)乙醇濃度升高,，酒精會(huì)影響細(xì)胞的正常功能,。
在很多情況下，細(xì)胞培養(yǎng)必須使用恒溫恒濕培養(yǎng)箱,。為了有效的控制該污染途徑,，可采取的措施有：①在加濕托盤(pán)內(nèi)添加真菌抑制劑，如硫酸銅,、十二烷基磺酸鈉,，可抑制托盤(pán)內(nèi)真菌的生長(zhǎng)；亦或盛裝無(wú)菌的去離子水,，并每周進(jìn)行更換,，托盤(pán)用消毒酒精或高溫滅菌的方法進(jìn)行嚴(yán)格的清潔；②使用無(wú)毒抗真菌清潔劑對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)外進(jìn)行定期清潔，先用清潔劑,、再用消毒酒精進(jìn)行擦拭,；為不留死角，清潔前應(yīng)將培養(yǎng)箱內(nèi)部能拆卸的部件都拆卸下來(lái),，清潔時(shí)也特別要注意不能拆卸的犄角旮旯處,；③不正確的使用空氣過(guò)濾器，那將變?yōu)榕囵B(yǎng)箱一個(gè)可怕的污染途徑,，故須按使用說(shuō)明定期更換空氣過(guò)濾器,；④在使用過(guò)程中，任何溢出液必須立刻用消毒酒精清除干凈,；⑤一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物被污染,，立馬清走。
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