手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理及應(yīng)用
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光集團(tuán),，利用熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析,。
其特點(diǎn)有：
(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量,，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè),，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性,，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染,，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程,。
(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA,，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度,、特異性和精確性,。Real-timeO-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè),、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定,、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè),。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理
在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán),，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動(dòng)檢出,，利用熒光信號(hào)積累,，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中,，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo),。并且引入一個(gè)——Ct值（Thresholdcycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的小循環(huán)數(shù),，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù),。
熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào),，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值,。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式,。
方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率,，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R²＞0.99）,，這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量,。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件,，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用
1.基因工程研究領(lǐng)域
?、倩虮磉_(dá)研究：對(duì)β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè),，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確,，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù),。
②轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值,，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對(duì)照基因,，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果,。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途,。
?、蹎魏塑账岫鄳B(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測(cè)基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針,，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針,，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交,。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變,，探針雜交便*配對(duì),，如有突變，則探針與靶序列不*配對(duì),，會(huì)降低雜交體得穩(wěn)定性,，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對(duì)突變和多態(tài)性進(jìn)行分析,。
2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域
?、俨≡w檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便,、快速,、結(jié)果判斷客觀，目前,，人們用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒,、肝炎病毒,、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒,、EB病毒,、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測(cè),。熒光定量PCR問世后的幾年中,，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料,，這些研究資料不斷豐富,，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。
?、谒幬锆熜Э己耍豪脤?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的可靠方法,，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。
?、勰[瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化,，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來,。目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因,、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因,、白血病WTI基因,、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因,、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè),。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用,。
3.其他領(lǐng)域
用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面,。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載,、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,，并注明“來源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任,。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源（非化工儀器網(wǎng)）的作品,，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任,。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容,、版權(quán)等問題,，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利,。
采購中心