本期講堂,，作為PCR基礎(chǔ)知識的開篇,，我們先來了解一下最基礎(chǔ)的PCR原理、操作流程,、成功的要素這三部分內(nèi)容,。

PCR作為一項基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，由于操作簡便,、省時,、靈敏度高等優(yōu)點,，在生物科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛：從克隆,、基因編輯、下一代測序（NGS）到基因分型,、法醫(yī)zhencha,、病原鑒定等，都離不開PCR技術(shù)的助力分析,。

首先我們先來了解一下PCR的原理，

一,、PCR原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下,，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點,，通過變性,、退火,、延伸等步驟,，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù),，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA,?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析,，基因表達(dá)調(diào)控,，基因多態(tài)性研究等許多方面。

理論上,，每一輪循環(huán)可使DNA的數(shù)量增加一倍,，經(jīng)過n次循環(huán)后，反應(yīng)混合物中所含的DNA數(shù)量為2n,。

二,、PCR操作流程

①DNA制備

從樣品中提取PCR反應(yīng)所需的DNA模板、直接PCR無需此步,。
推薦商品化的核酸提取試劑,，節(jié)省時間、簡化操作流程,、減少DNA提取量的損失,。

②PCR反應(yīng)

包括反應(yīng)液的制備和PCR反應(yīng)兩個步驟。

反應(yīng)液的制備
普通PCR的反應(yīng)體系由DNA聚合酶,、PCR反應(yīng)緩沖液,、4 種dNTP、引物及靶序列DNA模板這五大要素組成,。商品化的DNA聚合酶,，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應(yīng)緩沖液，因此僅需我們準(zhǔn)備引物及DNA模板,，并且根據(jù)說明書推薦量進(jìn)行反應(yīng)液配制即可,。

PCR反應(yīng)
選擇適宜的梯度PCR儀，根據(jù)擴增片段大小及酶制品說明書推薦來進(jìn)行PCR反應(yīng)條件設(shè)置,。

③電泳,、染色

PCR反應(yīng)后，通過凝膠電泳確認(rèn)擴增片段大小,。

三,、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液,、4 種dNTP,、引物及靶序列DNA模板是構(gòu)成PCR反應(yīng)組分的五大要素，這是影響PCR成功的內(nèi)因,；PCR反應(yīng)條件的設(shè)置,，是影響PCR成功的外因。

酶 

之前提到過商品化的DNA聚合酶,，一般包含了適宜濃度的dNTP及最適反應(yīng)buffer,，因此酶的選擇至關(guān)重要，我們需要兼顧保真性、擴增特異性,、擴增速度,、擴增效率、模板復(fù)雜程度及擴增片段長度等,，選擇最適PCR酶,。

引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR反應(yīng)引物的濃度一般在0.1μm~1μm之間,，以zuidi引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。

模板

模板的完整性要好,，模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物。同時模板純度也盡量越純越好,，純度不好,，可用PCI（苯酚氯仿抽提）及EtOH（乙醇沉淀 ）精制。

模板添加量可以參考酶制品說明書及下表的建議模板量進(jìn)行添加,，加量過多會導(dǎo)致非特異性擴增產(chǎn)物增加：

反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件可以參考酶制品說明書及下表進(jìn)行設(shè)置：

四,、常見問題

1.假陰性

不出現(xiàn)擴增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑,，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚,。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時,，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。

2.陰性

需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠,。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴增條帶不理想,、容易彌散的常見原因。

3.假陽性

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊,，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴增時,，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時,，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補后,，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補,、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）,。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。