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數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展和原理

來源:北京伯聯(lián)商貿(mào)有限公司   2021年08月27日 15:55  
 在定量PCR時,,我們常常糾結(jié)一個問題,究竟是相對定量還是定量呢,?如今,,你無需糾結(jié)了,,因為數(shù)字PCR(digitalPCR)來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似,,都是估計起始樣品中的核酸量,,但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量,,而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù),,是對起始樣品的定量,。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域:拷貝數(shù)變異、突變檢測,、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達),、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析,、單細胞基因表達分析等,。[1-2]
  技術(shù)發(fā)展
  20世紀末,Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR,,dPCR)的概念,,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應單元,,每個單元至少包含一個拷貝的目標分子(DNA模板),,在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增,擴增結(jié)束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析,。[1][3]
  數(shù)字PCR是一種核酸分子定量技術(shù),。當前核酸分子的定量有三種方法,光度法基于核酸分子的吸光度來定量,;實時熒光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值,,Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環(huán)數(shù);數(shù)字PCR是的定量技術(shù),,基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸定量,,是一種定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法,,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中,,每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后,,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積,,就可以推算出原始溶液的核酸濃度,。
  原理
  PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應,,擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。

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