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在定量PCR時,，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是定量呢,？如今,，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digitalPCR）來了,。盡管這兩種技術(shù)有些類似,，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別,。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量,，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的定量,。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異,、突變檢測、基因相對表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）,、二代測序結(jié)果驗證,、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等,。[1-2]
技術(shù)發(fā)展
20世紀(jì)末,，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念,，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板),，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴增,，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。[1][3]
數(shù)字PCR是一種核酸分子定量技術(shù),。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法,，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（RealTimePCR）基于Ct值,，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應(yīng)的循環(huán)數(shù),；數(shù)字PCR是的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計數(shù)的核酸定量,，是一種定量的方法,。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法,，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個,。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后,，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號,，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號,。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度,。
原理
PCR實際上是一個在模板DNA,、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng),，擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合,。
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