很多人拿到一個質(zhì)粒圖譜,，第一反應(yīng)只能是仰天長嘯,，這是什么玩意？這些 ori,、RBS,、tet 是什么鬼？這些箭頭代表什么,，轉(zhuǎn)錄的方向嗎,？為什么都不相同，不會“撞車”么,？ 來,，看幾張圖，上面的問題就能一一破解,。

第一步：先了解質(zhì)粒的基本組成元素,。

1）復(fù)制起始點 Ori。該位點決定了質(zhì)粒的宿主及質(zhì)粒的拷貝數(shù),，它是質(zhì)粒中一段特定序列,，富含 AT 和重復(fù)序列。

Tips：圖譜上只有一個 Ori，表示質(zhì)粒是原核克隆表達質(zhì)粒,；有兩個 Ori,，則表示該質(zhì)粒是，穿梭質(zhì)粒,，即可在原核也可在真核中復(fù)制,。

2）抗性篩選基因。圖譜中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因,，方便后續(xù)通過抗生素篩選陽性克隆,。特點就是單詞最后會以大寫 R 或上標(biāo) r 結(jié)束。

Tips：一般克隆載體只有一種抗性篩選標(biāo)記,，部分表達載體及穿梭質(zhì)粒具有兩種抗性篩選標(biāo)記,。

3）多克隆位點（MCS），即一系列限制性內(nèi)切酶酶切位點,，是外源 DNA 插入位點,，一般可通過酶切/連接方式將外源 DNA 插入質(zhì)粒，外源 DNA 一般小于 10kb,，而片段越長,，轉(zhuǎn)化效率越低。

Tips: 一般位于轉(zhuǎn)錄啟動和轉(zhuǎn)錄終止信號之間,；所包含的限制性內(nèi)切酶位點數(shù)量和組成因載體不同會有所差異,，且其中的酶切位點在質(zhì)粒中為單一的酶切位點；同時在使用時需注意質(zhì)粒載體與外源 DNA 酶切位點的兼容性問題熒光標(biāo)記或蛋白標(biāo)簽序列,。蛋白純化標(biāo)簽蛋白：His-Tag,，GST-Tag 等；蛋白檢測標(biāo)簽蛋白：Myc-Tag,，F(xiàn)lag-Tag,，HA-Tag 等；熒光蛋白表達標(biāo)簽：GFP,，mCherry 等,。

第二步：看質(zhì)粒是否是表達載體，如果是,，那就必定有這些原件：啟動子－核糖體結(jié)合位 點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號,。

1、啟動子：促進 DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列,，可與 RNApol 特異性結(jié)合,。

2、增強子/沉默子：前者是真核基因組中一種增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序,，其作用與增強子所在位置或方向無關(guān),。后者是負增強子,，負調(diào)控序列。

3,、核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列,。

4,、轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA  的保守序列，此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加 尾信號,。

第三步：弄清楚方向，即為何質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針而有的箭頭逆時針,。

其實那是代表兩條 DNA 鏈,，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上,，而它的某些基因在另一條鏈上,。當(dāng)然，最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（從 T7 啟動子到終止子那一段）的方向,，即下圖黃色圈圈所示的箭頭方向,，其它的大可以忽略。