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超濾離心管如何使用,？
超濾離心管如何使用,？
【問(wèn)】：millipore超濾離心管想重復(fù)使用，請(qǐng)問(wèn)如何清洗和保存,？
最近使用超濾管,，由于管子較貴，想重復(fù)用幾次,，但找不到可靠的資料,。不知如何清洗和保存，比如有人說(shuō)用DIE氮化鈉，有人說(shuō)用氫氧化鈉,，有人說(shuō)用乙醇浸泡,。莫衷一是。很急用,。
【回答精要】
使用后用0.1M NaOH泡24h,，然后20%乙醇浸泡保存。
這個(gè)我是聽(tīng)老板們說(shuō)的,，的確乙醇泡完后孔徑會(huì)增大,，基本就是5-10KD最大，也就是說(shuō)如果你的蛋白在21KD以上,，應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題,。或者可以不用乙醇泡,，用NaOH洗之后直接用無(wú)菌水保存,，每周換一下液體，應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題,。
看看說(shuō)明書不就結(jié)了,！我原來(lái)在CRO的時(shí)候一直是重復(fù)用的，也沒(méi)見(jiàn)什么不好??！短期會(huì)用的話，用20%的乙醇泡著,，回頭拼命用millipore的水充干凈,，然后在用樣品緩沖液平衡一下就好，至于有些人說(shuō)的改變孔徑,，也沒(méi)那么大影響的,，你至少跟目的蛋白分子量差別3倍的截留分子量才安全的不是嗎?1個(gè)月以內(nèi)不用的話，建議用100mM的NaOH保存,！更長(zhǎng)時(shí)間的話加0.02%的疊氮鈉，但那個(gè)東西強(qiáng)致癌物,，不建議使用,。
理論上截留目標(biāo)物，孔徑應(yīng)選1/3~1/5的膜,；透過(guò)目標(biāo)物,，孔徑應(yīng)選5-10倍的膜。
【問(wèn)】準(zhǔn)備用millipore 的超濾離心管從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中濃縮蛋白,，在園子里找到一些關(guān)于濃縮蛋白的一些帖子,，但還有些問(wèn)題還是向園子里的大蝦請(qǐng)教一下。我們定的是Amicon Ultra 15ml規(guī)格的管子,，不知道有沒(méi)有誰(shuí)以前做過(guò)的,，有關(guān)于轉(zhuǎn)速,，時(shí)間給一些建議，另外細(xì)胞上清液離心前是否需要什么預(yù)處理,？離心之后回收蛋白時(shí)怎么盡量減少損失,？如果要把管子重復(fù)利用，NaoH清洗后,，如何在20%的乙醇中保存,？是將其浸到乙醇中防于4度，還是在管子中灌入乙醇,？
【回答精要】
我用過(guò)5ml的管子,，當(dāng)時(shí)使用的轉(zhuǎn)速是4000rpm 8min，可以把5ml的樣品液濃縮到約200ul,，這僅供參考,，具體情況還要由您的樣品決定。
我保存5ml管子的方法是把內(nèi)管取出,，浸泡于裝有20％乙醇的燒杯中,。四度保存。
該種管子可以脫鹽濃縮但不宜根據(jù)截留半徑做分離蛋白用,。
我用的是3500g,，4度離心，時(shí)間可以自己控制,，取決于你最終的濃縮體積,，我一般是200ul左右。
千萬(wàn)別一下離心時(shí)間太長(zhǎng),，不同的蛋白濃縮的速度不同,，有的需要長(zhǎng)時(shí)間離心，有的則一下子就好,。當(dāng)然也和你的蛋白是否比較純,，所用的是什么buffer，還有蛋白的濃度有關(guān)系,。所以離心時(shí)要先短些時(shí)間觀察一下你的濃縮速度,，不要一下子濃縮過(guò)了，甚至形成沉淀就得不償失了,。
另外其實(shí)他們的管子都設(shè)計(jì)的是一次性使用,，所以如果想重復(fù)使用，不要離得速度太高,，4000－4500RPM就差不多了,，另外重復(fù)使用時(shí)要看看管壁上有沒(méi)有裂紋，現(xiàn)在的管子好像不如從前的結(jié)實(shí)了。
用后把管子用純水洗干凈,，離心少時(shí),，洗一下膜，再象propeg主任說(shuō)的那樣收起來(lái)即可,。使用多次后若覺(jué)得有些堵,，就可以用NaOH泡泡，離心幾分鐘,，應(yīng)該會(huì)有改善,。
純化多肽，截?cái)喾肿恿靠梢赃x10倍,，純化球蛋白,，截?cái)喾肿恿靠梢赃x3倍，如管子要重復(fù)使用,，轉(zhuǎn)速設(shè)最大轉(zhuǎn)速（G）的80％左右,，不然時(shí)間長(zhǎng)了塑料就裂了，膜也容易出問(wèn)題,。
離心后管子用MilliQ水清洗干凈,，浸泡在水中，4度保存就行了,，不放心就放點(diǎn)防腐劑,，但是這個(gè)管今后只能用來(lái)離心同類的樣品哦。
超濾損失蛋白是正常的,，樣品體積大就分批離心,，別搞的離心時(shí)間太長(zhǎng)，樣品里的雜質(zhì)如果可能盡量在離心前去除一些,。
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