U343-LUC人神經(jīng)膠質(zhì)母熒光素酶標記細胞瘤細胞 培養(yǎng)方法

上海市東方醫(yī)院,，上海市di一婦嬰保健院供應人臍帶間充質(zhì)干細胞,，人脂肪干細胞,，無血清細胞凍存液,，IPS功能性細胞,，HUVEC細胞,，各類細胞株細胞系,，所有人源細胞均STR鑒定后入庫,。并供應各類血清,，培養(yǎng)基，胰酶，雙抗,，*培養(yǎng)基等,。

規(guī)格：T25瓶

形態(tài)特征：多角　

生長狀態(tài)：貼壁生長

是否STR鑒定：

培養(yǎng)條件：EMEM + 2mM Glutamine + 1% NEAA + 1mM Sodium Pyruvate (NaP) + 10% FBS.（推薦HAKATA優(yōu)等胎牛血清貨號：HN-FBS-500）

傳代方法：1:3傳代；3~4天1次,。

U343-LUC人神經(jīng)膠質(zhì)母熒光素酶標記細胞瘤細胞 培養(yǎng)方法

支原體檢測：陰性

使用權限：A類

參考文獻：Amelogenin:X,；CSF1PO:11,12；D13S317:10,11,；D16S539:12,；D18S51:13；D19S433:13,15,；D21S11:29,；D2S1338:22,24；D3S1358:16,17,；D5S818:11,12,；D7S820:10,12；D8S1179:13,15,；FGA:21,25,；TH01:9.3；TPOX:8,；vWA:16,18

復蘇周期：10個工作日左右

傳代培養(yǎng)及其操作步驟：原代細胞培養(yǎng)成功以后,，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大,，營養(yǎng)障礙,，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng),。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株),，可以進行細胞克隆，易于保存,，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征,。傳代細胞形成細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗,。傳代細胞培養(yǎng)操作步驟：１)吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,；２)向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜,；３)置３７℃孵箱或室溫(２５℃溫度)下進行消化,，２-５min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,、細胞間隙增大后,，應立即中止消化,；４)吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量,，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液,。如果僅使用胰蛋白酶消化,，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液,，終止消化,；５)使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞,，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔,，以防用力過猛損傷細胞,；６)用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中,，置CO２培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),；７)細胞培養(yǎng)換液時間應根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般２-３d后應換一次生長液,。待細胞鋪滿器皿底面,，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液,。

培養(yǎng)步驟：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中）,，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度,。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

1,、對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細胞,，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。

PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后,，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi),，嚴格無菌操作；將小管細胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻,，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng),，視情況傳代或者凍存,。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）,。

2,、對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞,，1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,，將剩余細胞懸起,，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時,，可進行細胞凍存,。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶,，細胞變圓脫落后,，進行離心收集,，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清,，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO,，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

PS：若客戶收到2ml小管細胞,，收到細胞后,，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴格無菌操作,；將小管細胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細胞密度：若密度未超過80%,，換液繼續(xù)培養(yǎng),，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%,，可直接進行傳代（方法同上）,。

處理方法：

1. 收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置若干小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài),。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài),，100×，200×各一張）,，觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況,。作為我方進行售后的依據(jù)。

2. 收到細胞未開封,，出現(xiàn)污染狀況我們負責免費重發(fā)一次細胞,。

3. 由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩氐挠绊?，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài),，故客戶需要售后是需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后與客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天,。

4. 如客戶對細胞的種類,、純度、活性等特性有疑問,，需提供相應的生物學實驗檢測結(jié)果作為依據(jù)。