41,、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎,？

答：沒什么問題,，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來,，在里面加點水保持濕度就可以了,；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察,；能夠替換的試劑,，盡量換一下,，選用好的試劑。

42,、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,，如要分離小21KD，中至66KD,，大至170KD,，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移,，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn),，12％SDS-PAGE， 濕轉(zhuǎn)120mA,， 45-60min就可以了,， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE,，200mA 90-120min,。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上,， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決,？

答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率,，但可增加蛋白質(zhì)和PVDF膜的結(jié)合能力,，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間,；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜,，或使用小孔徑的PVDF膜（0.2微米）,。

44、我用的是可視marker,，但是電泳總跑不全8條帶,，請問什么原因？怎樣改善,？膠用過8％,，10％，12％,，都是這樣,。marker是新買的。

答：一般來說,，是小分子量Marker跑走了,，增加膠濃度或減少電泳時間試試看,。當然梯度膠也是不錯的選擇。

45,、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？

答：半定量實驗需要有內(nèi)參,。

46,、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白,，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的,，有很多都可以當成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參,。

47,、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin,，GAPDH哪個好,？

答：兩者均可。

48,、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎,？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎,？

答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法,，一般來說都沒有區(qū)別,。

49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”,，其中TBST最后那個T是Tween嗎,，濃度多大？

答：是Tween,，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g,， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50,、封閉,，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢,，比如在室溫里做,，或者要在4度下?

答：均可在室溫進行，如果時間不夠,，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時,，然后4度過夜,。

51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么,？

答：一般而言,，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話,，反復(fù)洗幾次后,，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差,。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,，同時也有疏水作用，但相對較弱,。這樣的話,，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落,，結(jié)果較好,。

52、怎樣才能把膠跑的非常漂亮,，泳道都能很直,，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求,？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量,，有以下幾個因素：

（1）電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮,。電壓越小,，條帶越漂亮，濃縮膠55v,，分離膠75v就能跑得很好,。

（2）膠的均勻度，膠越均勻,，條帶越窄,，分離越均勻。倒膠之前,，一定要充分混勻,，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時,，一定要比較輕地加上去,，避免稀釋上層的分離膠.

53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時候,，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過程中,，會透過膜去,，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了,。

54．電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：

●︶ 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻,，中間冷卻不好; 電泳系統(tǒng)溫度偏高。

●︵ 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由于裝置不合適,，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,，或者兩邊聚合不*。

●拖尾

原因：樣品溶解不好,。

●紋理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒。

●條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜,。

●條帶兩邊擴散

原因：加樣量過多,。

55．Western blot結(jié)果中背景較高

可能的原因及建議：

●膜封閉不夠

延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液,。

●一抗稀釋度不適宜

對抗體進行滴度測試,，選擇最適宜的抗體稀釋度。

●一抗孵育的溫度偏高

建議4℃結(jié)合過夜,。

●選擇的膜容易產(chǎn)生高背景

一般硝酸纖維素膜的背景會比PVDF膜低,。

●膜在實驗過程中干過

實驗過程中要注意保持膜的濕潤。

●檢測時曝光時間過長

減少曝光時間,。

56．Western blot結(jié)果中雜帶較多

可能的原因及建議：

●目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點,、糖基化位點、乙?；稽c等）,，本身可以呈現(xiàn)多條帶。

查閱文獻或進行生物信息學(xué)分析,，獲得蛋白序列的修飾位點信息,，通過去修飾確定蛋白實際大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查閱文獻或生物信息學(xué)分析可能性,。

●樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解

加入蛋白酶抑制劑,；樣本處理時在冰上操作。

●上樣量過高,，太敏感

適當減少上樣量,。

●一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體。

●一抗不純

純化抗體

●一抗或者二抗?jié)舛绕?/span>

降低抗體濃度,。

57 . Western blot結(jié)果中無信號或顯示信號弱

可能的原因及建議：

●檢測樣本不表達目的蛋白

選擇表達量高的細胞作為陽性對照,，用于確定檢測樣本是否為陰性。

●檢測樣本低表達目的蛋白

提高上樣量,，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑,。

●轉(zhuǎn)移不*或過轉(zhuǎn)移

可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭,；適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流。

●抗體不能識別測試種屬的相關(guān)蛋白

購買抗體前應(yīng)當認真閱讀抗體說明書,，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應(yīng)蛋白,。

●一抗孵育時間不足

建議4℃結(jié)合過夜。

●二抗與一抗不匹配

選擇針對一抗來源的種屬的抗體,。

●洗膜過度

洗膜時間不宜過長,，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20,。

58. 其它現(xiàn)象：

●膜上多處出現(xiàn)黑點或黑斑

原因：抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合,。

●反白（條帶顯白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/span>

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠,；小分子蛋白要用高濃度膠,。

59．安全問題：

操作有毒試劑時，帶手套,，且操作揮發(fā)性試劑應(yīng)在通風櫥中進行,。