Western blot實驗過程中常見問題匯總及處理方案,。

1、western blot 的優(yōu)點及缺點

答： 優(yōu)點：靈敏，特異性高，常規(guī)可達ng級,，Ecl顯色法理論上可達pg 級。

     缺點：通量有限,。

2,、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白,？

答： 原因有很多：首先排除WB過程是不是抗體的問題,，重新實驗、更換抗體,；其次排除蛋白是否降解,，提取的時候需要加入蛋白酶抑制劑， a) 你的細胞中不表達這種蛋白質(zhì),，換一種細胞,；最后考慮此種細胞是否表達該蛋白，表達量高低,。

3,、提取液有的有沉淀，有的很清亮,，為什么呢,？

答： a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度,，同時將樣品煮沸時間延長,， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可,。

4,、蛋白質(zhì)分子量很小（10KD）,，WB實驗過程該注意哪些問題,？

答：可以選擇0.2μm的PVDF膜，同時縮短轉(zhuǎn)膜時間,。

5,、目的條帶很弱，如何加強,？

答：可以加大抗原上樣量,，這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低,。

6,、膠片背景很臟,，解決方法？

答：減少抗原上樣量,，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高封閉時間,。

7,、目標帶是空白，周圍有背景,，是為什么,？

答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強,，同時你的顯色底物處于一個臨界點,，反應時間不長，將周圍底物催化完,，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”,。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物,。

8,、我的膠片是一片空白，是怎么回事,？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上,。

a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光,；

b) ECM底物中H2O2,，不穩(wěn)定，失活,；

c) ECL底物沒覆蓋到相應位置,；

d) 二抗失活。

9,、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能膠片被曝光了,，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長,。

10,、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒,，但是比較靈敏,，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點,，但如果達到閥值,，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原,。要看你實驗的情況,。

11、抗原檢測出的分子量比資料上的大,，是怎么回事,？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,，煮沸變性時間延長,，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化,，磷酸化等,。

12,、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,，但膠上有，同時Marker 轉(zhuǎn)上去了,，為什么,？

答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時間不夠,。

13,、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,，一般最好加,。但是不加也可以，大部分時候是不用加的,。

14,、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎,？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎,？

答： ① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量,，而且有時會有假陽性,，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子,，進行定量,，但是不能定位。

② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗,，在免疫組化時,，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15,、做Western Blot時,，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗,，開始還有點痕跡,，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg,，換了個santa cloz的一抗仍不行,。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎,？

答：懷疑是樣品問題,，可能是：

1，樣品不能反復凍融,；

2,，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時,，建議檢查Western Blot過程,， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f,，一般加PMSF就可以了,，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

16,、細胞水平要做western blot,，多少細胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10^6就足夠了,。

17,、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響,？

答：能,，沒有問題。有商品化的試劑盒可以滿足,。

18,、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當然可以,，有的甚至可以同時測幾十種樣品,。

19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么,？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性,。

20,、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克,，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了,，有什么辦法可以解決,？

答：你可以加大上樣量，沒有問題,，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間,，加20％甲醇。