Gibson Assembly原理

Gibson Assembly原理示意圖

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能夠識別3’末端堿基,，具有3’→5’外切酶活性的特點,。通過In-Fusion酶產(chǎn)生5’黏性末端，互補重疊片段退火配對,；再將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),，重組片段序列中的缺刻在菌體內(nèi)進行連接，獲得重組序列,。

無縫克隆的優(yōu)勢

• 不受酶切位點限制

• 適用于任意載體,、任意片段

• 一步連接1或多個片段，連接多片段耗時短

• 插入目的片段兩端不會添加額外序列（如保護堿基）

無縫克隆實驗關(guān)鍵影響因素

片段質(zhì)量

• 確保DNA片段無核酸酶及其它酶污染,、無乙醇等殘留,；

• 純度正常：A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右,、紫外吸收峰圖正常,；

• 濃度正常：插入片段與線性化載體濃度高于50 ng/μl,，會使重組效率提高,；

• 若模板濃度低、純度低,，則連接效率降低,。

載體線性化方法

線性化載體可以選擇反向PCR或酶切的方法：

• 可根據(jù)在載體插入位置是否有合適的酶切位點選擇具體方法。因Gibson Assembly反應(yīng)體系內(nèi)無雙鏈DNA連接酶,，不會發(fā)生載體自連,，線性化載體不需要進行末端去磷酸化處理,。酶切制備線性化載體建議使用雙酶切，且酶切后采用膠回收的方法回收產(chǎn)物,，這樣利于降低假陽性,。

• 若沒有合適酶切位點或者多次酶切制備線性化載體均不成功，可以選擇反向PCR擴增,，但不適合較大質(zhì)粒,，如超過8 kb。
  

引物設(shè)計

• 目的片段引物設(shè)計：目的片段引物是由目的片段兩端序列加同源臂序列組成,，同源臂長度設(shè)置在16-45 bp,，Tm值在58–65°C。同源臂越長,，有利于重組置換,，但可能會影響目的片段擴增；

• 載體引物設(shè)計：確定目的片段插入位置,，推薦借助Snapgene軟件設(shè)計反向PCR引物,。

PCR擴增

• 反向PCR制備線性化載體及擴增目的片段時需要使用高保真酶；

• 制備線性化載體后使用Dpn I內(nèi)切酶消化環(huán)狀質(zhì)粒模板,，降低假陽性克隆,。

插入片段與線性化載體摩爾比

• 10 µl 反應(yīng)體系，載體與插入片段總加入量建議在 0.01-0.3 pmol,。插入片段與線性化載體的最佳摩爾比為 1:1-4:1,；片段與片段的摩爾比為1:1。

• 推薦使用GenStar 克隆連接反應(yīng)體系計算工具,，快速計算載體與目的片段使用量,。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率

• 插入片段與載體全長超過10 kb，屬于長片段克隆,，應(yīng)使用高效感受態(tài),；如：轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/μg DNA的感受態(tài)細(xì)胞。

• 感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒用量比例不小于10:1,。

  
  

只要注意以上幾點,，高效無縫克隆實驗輕松get。

什么,？不清楚無縫克隆實驗具體怎樣操作,？

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