NK細(xì)胞主要分布于外周血，占外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的5-10％,，無(wú)需抗原提呈細(xì)胞作為中介提呈抗原,，也無(wú)需抗體幫助，可直接清除衰老細(xì)胞,、變性細(xì)胞,、癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等。

NK細(xì)胞屬于白細(xì)胞的一種,，它是人體忠誠(chéng)的衛(wèi)士,，主要任務(wù)就是消滅那些已經(jīng)被病毒感染的細(xì)胞,，從而把病毒消滅在“搖籃”中。另外,，身體里面的腫瘤細(xì)胞也是它們追殺的對(duì)象,。

NK細(xì)胞在機(jī)體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過(guò)程中起到非常重要的作用，是一種有效,、安全的腫瘤生物免疫治療方法,，具有廣闊的應(yīng)用前景。

分離培養(yǎng)NK細(xì)胞有多種方法,，以下是采用某種試劑盒的因子法體外培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)NK細(xì)胞：

這種方法采用自體外周血細(xì)胞中分離得到的單個(gè)核細(xì)胞,，經(jīng)體外操作使NK細(xì)胞擴(kuò)增活化，通過(guò)激活體 內(nèi)特異性免疫反應(yīng)達(dá)到殺火腫瘤細(xì)胞目的的一種體細(xì)胞治療方法,。

1.NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包含：

①無(wú)血清培養(yǎng)基2瓶（l000mL/瓶）：

②NK試劑A, 1支：

③NK試劑B, 1支：

④NK試劑C, 1支:

⑤NK試劑D, 1支：

⑥NK試劑E, 1支：

培養(yǎng)體系中需用到2支（100萬(wàn)IU/支）rH IL-2

2.原材料

1.采取外周血（可從臍血,、骨髓等組織）

2.需的試劑耗材包括：

0.4%苔盼藍(lán)溶液、生理鹽水,、人淋巴細(xì)胞分離液（建議選用GE）,、175cm²培養(yǎng)瓶、GT-T610 （A）培養(yǎng)袋,、15ral/50ml/250ml離心管,、移液管、1毫升無(wú)菌注射器

3.NK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)程:

前一天：要提前處理好細(xì)胞活化瓶（NK試劑A）

第1天：進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)(NK試劑B）

第3天：NK細(xì)胞第一次補(bǔ)液,，補(bǔ)液50ml（NK試劑C）

第5天:NK細(xì)胞第二次補(bǔ)液,，補(bǔ)液175ml (NK試劑D）

第7天：NK細(xì)胞第三次補(bǔ)液，裝袋并補(bǔ)液500ml (NK試劑E)

第9-10天：NK細(xì)胞第四次補(bǔ)液,，分袋并補(bǔ)液750ml

第12天：NK細(xì)胞第五次補(bǔ)液.補(bǔ)液500ml

第13天：檢菌

第14,、15天：培養(yǎng)成功

（細(xì)胞培養(yǎng)成功時(shí)間視具體細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，在保持培培養(yǎng)基ph和細(xì)胞活力正常的情況下也可以多培養(yǎng)一天）

4.具體操作步驟如下：

頭一天一定要先處理細(xì)胞活化瓶,。

2.將NK試劑A （4度保存）加入到含有12.5ml生理鹽水的175cm²底面積細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，充分的混勻 30秒-1分鐘,使液體充分在瓶底分散，4度冰箱平放過(guò)夜

(NK試劑A需要和生理鹽水充分混勻平鋪在瓶底,；次日取出后直接吸棄液體即可,，無(wú)需清洗）

3.外周血單個(gè)核細(xì)胞分離與誘導(dǎo)（第1天）

4.以100ml外周血為例，如血量不同,，也可按操作規(guī)程做相應(yīng)調(diào)整,。

5.將患者外周血，用移液訝吸取少許原血（約300 ul）劃線或滴入平皿過(guò)行檢菌,。然后,，正常室溫下,進(jìn)行離心。

6.將上層血漿轉(zhuǎn)入離心,，滅活,，離心,，取上清液備用。

7.使用等體積的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀混勻后,，小心加到Ficoll層上，使分層保持清晰,。室溫內(nèi)進(jìn)行離心,。

8.吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC）層，盡量吸盡兩液面交接處的細(xì)胞層.加生理鹽水吹打混勻,，離 心,。相同方法冉次洗滌細(xì)胞。

9.棄去上清后,，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù),。

10.按照細(xì)胞密度為1-2*10^6個(gè)/ml(*為5 *10^6個(gè)/ml）,用培養(yǎng)基清洗離心管，并入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，并加入1支NK試劑B,，患者滅活血漿1.25ml (5%）確保培養(yǎng)基終體積為25ml左右。剩余血漿4°C 密封保存?zhèn)溆谩?/span>

注：包被瓶取出時(shí)間為細(xì)胞加入前5分鐘,其他時(shí)間需在4度放置備用,。

試劑A,、B、C,、D,、E的取用.違議第一次吸取原液后.以適貴培養(yǎng)基沖洗西林瓶后再吸出，減少損耗

11.活化培養(yǎng)基的配置：其中1瓶無(wú)血清培養(yǎng)基中,，加入100萬(wàn)IU的IL-2,，終濃度為1000IU/mL。

注：活化培養(yǎng)基每次使用前恢復(fù)至室溫,。

12.NK細(xì)胞的第一補(bǔ)液（第3天）,，補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑C，確保培養(yǎng)的終體積為 75mL,。

13.NK細(xì)胞的第二次補(bǔ)液（第5天）,，補(bǔ)加含有5%的患者滅活血漿和NK試劑D,確保培養(yǎng)的終體積為 250ml。

14.NK細(xì)胞的第三次補(bǔ)液及其裝袋（第7天）,，細(xì)胞轉(zhuǎn)袋前將培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞進(jìn)行輕微吹散細(xì)胞,，隨后將培養(yǎng)瓶的中的細(xì)胞懸液及其500mL活化培養(yǎng)基，裝入到細(xì)胞培養(yǎng)袋中,，同時(shí)加入1支NK試劑E,，及其剩余的全部血漿，確保終體積為750ml,。

15.NK細(xì)胞的第四次補(bǔ)液（第9天）,，主要為分袋操作,，將培養(yǎng)體系由750ml擴(kuò)增至1500ml。

16.NK細(xì)胞的第五次補(bǔ)液（第!2天）.主要為補(bǔ)液操作,，將剩余的500mL擴(kuò)增液均分到2個(gè)培養(yǎng)袋中,，確保每袋體積為1000ml。

17.檢菌,，細(xì)胞培養(yǎng)第13天,，對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行檢菌、內(nèi)毒素檢測(cè),。用5ml注射器分別從培養(yǎng)瓶和袋內(nèi)抽取少最細(xì)胞懸液,，加入正置的平皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱,， 記錄放入日期及培養(yǎng)物品,。隔夜后倒置，保留48小時(shí),。