普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃，此時酶的活性最佳,，低于此溫度,，酶有較弱活性。在PCR擴增的升溫過程中,，酶發(fā)揮較弱的活性,，體系極易錯配或形成引物二聚體，尤其是當設計的引物3’端是G 或C,，錯配的鏈很難重新解開,。非特異性擴增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯誤引導靶標延伸和引物二聚體形成的。

非特異性擴增的具體影響包括：

• 目標擴增子產量低,；

• 目標擴增子的靈敏度下降,；

• 下游應用效果不佳。

因此,，要提高PCR 擴增的特異性和降低反應錯配率,，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性,，這樣就避免了在升溫（或配置反應體系）過程中發(fā)生鏈的錯配,，從而保證擴增的特異性。

而目前常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動型Taq DNA聚合酶進行擴增,，即熱啟動PCR,。

熱啟動PCR，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性,，加熱到變性溫度時修飾物失活，酶活得以釋放,，從而使PCR反應正常進行,。

熱啟動PCR的優(yōu)勢：

• 阻止引物與低同源性的模板序列結合；

• 在PCR反應開始之前,，防止引物與引物之間形成引物二聚體,；

• 提高目的片段的擴增靈敏度和產量；

• 可在室溫下配制反應體系和設置反應程序,，使操作更為便利,，且不會影響擴增性能和特異性。

熱啟動Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學修飾法,、抗體法和配體修飾法等,。其中化學修飾法和抗體法最為常用。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性,，但兩者之間存在一些差異,。

但是,，酶激活時間較長可能會影響酶的活性,，導致PCR產物的產量降低。

檸康酸酐與酶結合的原理

一般認為Taq DNA聚合酶上賴氨酸基團有42個左右,，但是由于空間結構限制,，其中一部分賴氨酸基團在基團內部，無法與化學修飾基團相結合,。

但其缺點是抗原抗體結合是一種動態(tài)平衡，試劑配比優(yōu)化時間長,。

抗體與DNA聚合酶特異性結合封閉原理示意圖

兩種熱啟動修飾方法的比較

熱啟動PCR目前的應用已是非常廣泛,，在較難擴增的PCR反應如基因組DNA、單拷貝序列的擴增,、多重PCR和超長片段的擴增中的應用尤為突出,。

優(yōu)質的熱啟動Taq DNA聚合酶，能有效降低或消除非特異性產物以及引物二聚體的形成,，提高引物與模板結合的效率,。

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