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超微量紫外可見分光光度計是通過檢測物質(zhì)波長處或某一波長范疇內(nèi)光的吸收度,，對物質(zhì)進(jìn)行定量與定量分析的儀器設(shè)備,，目前已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)、藥物學(xué),、食品科學(xué)等領(lǐng)域的常用儀器,。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。
2,、核酸的純度檢測
3,、蛋白質(zhì)直接定量
4,、比色法蛋白質(zhì)定量（顏色反應(yīng)）
5,、OD600（菌落密度）
1,、核酸的定量
核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。
分光光度計的設(shè)計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化都是正常的,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度,。影響吸光值A(chǔ)的幾個因素如下：
（1）核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等:在測試時,，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液。
（2）樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了盡可能減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高(超過光度計的測試范
（3）操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個操作事項,。
2,、核酸的純度檢測
除了核酸濃度，超微量分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如：
（1）A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品,，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。
（2）A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,，多肽,，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。
（3）A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品，A320一般是0,。
3,、蛋白質(zhì)直接定量
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白,。超微量分光光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm的"背景"信息，設(shè)定此功能"開",。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值大于0.1A，的線性范圍在1.0-1.5之間,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾;另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。
4,、比色法蛋白質(zhì)定量（顏色反應(yīng)）
蛋白質(zhì)比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry等幾種方法,。
由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。所以在選擇比色法之前,，最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。
比色法定量蛋白質(zhì),，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。因為比色皿中的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間,，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品)，都必須在此時間內(nèi)測試,。時間過長,，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低,。反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外,，非常重要的是,，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色皿,，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,。
5,、OD600（菌落密度）
實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實驗,，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。通過檢測600nm處細(xì)胞生長培養(yǎng)的吸光度,，從而監(jiān)測微生物或其他細(xì)胞培養(yǎng)的生長率,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。
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