做ELISA實(shí)驗(yàn),,這些技巧少不了!
介紹:
ELISA試劑盒在國(guó)內(nèi)有許多種叫法,,例如:ELISA檢測(cè)試劑盒,、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒,、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒,、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等,比較常見的叫法是ELISA檢測(cè)試劑盒,、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒等,。
Elisa生物試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),,重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法,。由于其試劑穩(wěn)定、易保存,,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果判斷較客觀等因素,,已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中,。
特點(diǎn):
1.高效、靈敏,、特異的抗體,。
2.穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性。
3.吸附性能好,,空白值低,,孔底透明度高的固相載體。
4.適用血清,、血漿,、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液,、尿液等多種標(biāo)本類型,。
5.節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。
操作方法
1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋,,請(qǐng)按照說明書進(jìn)行操作,。
2.根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加樣:不規(guī)范的移液操作可能帶來誤差,。
1)空白孔,,空白對(duì)照孔不加樣品,生物素標(biāo)記的抗NE抗體,,鏈霉親和素-HRP,,只加顯色劑A&B和終止液,其余各步操作相同,;
2)標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul,,鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體,故不加);
3)待測(cè)樣品孔:加入樣本40ul,,然后各加入抗NE抗體10ul,、鏈霉親和素-HRP50ul,蓋上封板膜,,輕輕震蕩混勻,,37℃溫育60分鐘。
4. 配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,,棄去液體,甩干,,每孔加滿洗滌液,,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,,拍干,。
6. 顯色:每孔先加入顯色劑A50ul,再加入顯色劑B50μl,,輕輕震蕩混勻,,37℃避光顯色15分鐘。
7. 終止:每孔加終止液50μl,,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色),。
8. 測(cè)定:以空白孔調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值),。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度,。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算,。
洗板方法
一、手工洗板方法:
甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次,。
二,、自動(dòng)洗板:
如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。
注意事項(xiàng)
1.從2-8℃取出的試劑盒,,在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘,。酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差,。
3.嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
4.為避免交叉污染,,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜,。
5.不同批次試劑盒不能混用,如遇試劑不夠,,請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系客服解決
6.底物B對(duì)光敏感,,避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。
7.中,、英文說明書或許會(huì)有不一致之處,,請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn),。
8.保存溫度:2-8℃,。
9.有效期:6個(gè)月(2-8℃)。
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