組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實驗等的發(fā)展而得到廣泛的應用,。對本文其中的冰凍切片、石蠟切片,、碳蠟切片,、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關(guān)操作步驟進行介紹,。

冰凍切片

是免疫組織化學染色中的一種切片方法,。其優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應 采用冰凍切片,。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片,。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶,，往往影響抗原定位,。一般認為冰晶少而大時,，影響較小，冰晶小而多時,，對組織結(jié)構(gòu)損害較大,，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比,，而與成核率(形成速率)成反比,，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴重,。因此,，應盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認為冰凍開始時,，冰晶成核率較慢,，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33,。C, 從-30,。C降至-43。C之間,，成核率急劇增加達1018,，然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成,。

(1)速凍，使組織溫度驟降,，縮短從-33,。C43。C的時間,，減少冰晶的形成,。其方法有二：

①干冰-丙酮(酒精)法：將150-200ml丙酮(酒精)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰,，直至飽和呈粘稠狀,，再加干冰不再昌泡時，溫度可達-70℃C,，用一小燒杯(50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml,，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮(純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達-70℃時即可使用,。將組織(大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出,，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存,。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm),，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當盒底部接觸液氮時 即開始氣化沸騰,，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機冰凍切片,。

(2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天,，利用高滲吸收組織中水分,，減少組織含水量。

影響冰凍切片的因素較多,，因此,，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵,。目前冰凍切片機有兩類：

①恒慢冰凍切片機(Cryastat)：為較理想的冰凍切片機,，型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內(nèi),，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響,，可連續(xù)切薄片至2-4μm，*能滿足免疫組織化學標記要求,。切片時,，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎,，抗卷板的位置及角度要適當,，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動,。

②開放式冰凍切片機：包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2,、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中,，溫度不易控制,，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節(jié) ,，切片更加困難,，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片,，但其優(yōu)點是價廉,，國內(nèi)有生產(chǎn)。

冰凍切片后如不染色,，必須吹干,，貯存低溫冰箱內(nèi),， 或進行短暫預固定后貯存冰箱保存

石蠟切片

其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值,，能切連續(xù)薄片,，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準確,。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水,、透明等過程應在4℃。C下進行,，以盡量減少組織抗原的損失,。②組織塊大小應限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水,、透明,、浸蠟。③浸蠟,、包埋過程中,，石蠟應保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好(即低溫石蠟包埋),。

以上全過程為18-24h,，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替。如組織塊小,，直徑小于0.5cm,，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右,。

石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù),，切片機多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm,，應用范圍廣,，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致,。由于甲醛固定,、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變,。有人報告經(jīng)蛋白酶消化,，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶,、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法,。石蠟切片應入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存,，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用,。

石蠟切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精,、二甲苯等有機溶劑處理,，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法(Freeze drying embedding methed),，可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì),，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失,。該法是將新鮮組織低溫速凍,，利用冷凍干燥機(Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ,，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織,，最后將組織浸蠟,、包埋,、切片。此法可用于免疫熒光標記,、免疫酶標記及放射自顯影,。

振動切片

用振動切片機(Vibratotme)，可以把新鮮組織(不固定不冰凍)切成厚片20～100μm,，以漂浮法在反應板進行免疫組織化學染色,，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位，修整組織進行后固定,，最后按電鏡樣品制備,、脫水、包埋,、超薄切片,、染色觀察等。組織不冰凍,，無冰晶形成和組織抗原破壞,，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明,、包埋等步驟對抗原的損害,，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究,。這種包埋前染色,，尤其實用于免疫電鏡觀察。

塑料切片

塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(Glycol methacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類(Epon 812,618)，其優(yōu)點是可以同時作光鏡和電鏡檢測,，能相互對照所查抗原,，定位準確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片,，光鏡切片可薄至0.5～2um,，故稱半薄切片(Semithin section)。GMA保存抗原較好,，不與組織產(chǎn)生共聚合,，但形態(tài)學結(jié)構(gòu)欠佳。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學結(jié)構(gòu),，但在聚合過程中易和組織起作用,，改變抗原結(jié)構(gòu)。塑料包埋切片由于處理程序繁多,，抗原活性易丟失,。同時半薄切片進行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂,，因此,，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標本,，切片薄切片后不需染色,，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應部位呈黑點狀，定位后進一步作超薄切片,，這樣,，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。

超薄切片

電鏡標本制作,，應用超薄切片機(Ultrotome)進行切片,。

碳蠟切片

碳蠟(Carbowax)，學名聚乙烯二醇(Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟,。根據(jù)其分子量不同,，碳蠟有多種，如400,、800,、1000、1500,、4000,、6000等，用于組織包埋的有1500,、4000兩種,，其熔點分別38℃C和52,。C左右，常溫下為固體石蠟狀,，加溫熔化呈液體狀,。

本法的特點是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋,，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同,。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化,，組織片即可展平,，制片過程簡單易行。

具體操作簡述如下：組織塊不宜過大,，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi),。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水,。②將組織浸入碳蠟(1500)內(nèi),，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液(1500和4000等量混合液),，52℃ 30min,。④浸入等量混合碳蠟液(或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例,，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合,，反之，則2：3混合),。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同,。在操作過程中,，碳蠟組織塊應盡量避免與水或冰接觸，貯存時應密封干燥冷藏,。

本法優(yōu)點是操作程序減少,，時間縮短，組織不經(jīng)有機溶劑損害,、溫度低,、抗原性保存比石蠟切片好，組織結(jié)構(gòu)清晰,。缺點是夏季室溫高時切片較困難,，連續(xù)切片不如石蠟切片順利;由于碳蠟有強吸濕性，不易保存時間較長,。