很多細胞實驗都要檢測熒光，為方便大家選擇合適的方法,，在此簡單說一下各種熒光檢測方法的特點,。不足的地方,，歡迎大家補充：

1,、流式,，優(yōu)點是速度快,，非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計,，且樣品只被檢測一次,，*不用擔(dān)心熒光淬滅的問題。缺點是只能檢測熒光的有無,、強度大小,，無法提供空間定位信息，無法做熒光定位變化的實驗,；由于樣品只被檢測一次,，因此無法對同一個樣品進行連續(xù)觀察。例如,，做膜蛋白定位時會得到這么一個結(jié)果——用流式可以檢測出信號,，但是用顯微鏡卻看不到東西,，排除儀器和濾光片選擇問題，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽性結(jié)果,。

2,、熒光顯微鏡，剛好與流式互補,，可很好地進行空間觀察,，判斷目標(biāo)蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測,，估計沒人能經(jīng)得起時間的考驗,。有不同倍率的物鏡選擇，可以使用高倍物鏡看精細結(jié)構(gòu),，或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計,。與之搭配的CCD和軟件，是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵,。尤其是CCD,，從那么多商品里選一款合適的不容易，需要了解很多知識否則只能聽別人忽悠,。

3,、共聚焦，熒光顯微鏡的升級產(chǎn)品,，具有很好的光學(xué)層切效果，能得到很好三維定位信息,。但是,，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片,，就讓人覺得可惜了,。共聚焦基本都是全自動系統(tǒng)，可隨意定義照明區(qū)域,、選擇多個熒光通路和設(shè)定定時取圖,，所以，做Time-laps,、FRAP和FRET有其獨到的優(yōu)勢,。另外，4Pi和STED又是其中的極,，具有超高的空間分辨率,，只是使用不方便，未必適合做生物實驗,。

4,、全內(nèi)反射,，熒光顯微鏡的另一種升級產(chǎn)品，屬于近場光學(xué)范疇,，只適合且合做膜研究,，無法看到胞內(nèi)信息。也是用CCD成像,，但是對CCD的要求更高——個人甚至覺得對CCD的要求是沒有上限的,。

5、雙光子,，另一種共聚焦,，因使用長波激發(fā)熒光，故能做深層檢測（突破共聚焦的100微米極限）,，典型的應(yīng)用是觀察活體腦組織,。巨貴無比，國內(nèi)沒有幾臺,，能用上的人不多——就不說了,。

6、新推出的高內(nèi)涵藥篩系統(tǒng),，流式和顯微鏡的雜合體,，使用電動載物臺，可以自動地按預(yù)定程序完成實驗,，可做大流量檢測（雖然速度慢點）,，而且有成像能力，可以判斷定位,。前段時間,，國內(nèi)哪裝了一臺，很多人在吹,，但我實在不知道其中的好處——任何一臺帶電動載物臺的顯微鏡都可以達到相似的效果,，只要軟件支持——估計有人賺大發(fā)啦！

從以上的簡介可以看出,，只要是熒光樣品,，就應(yīng)該都可使用以上儀器檢測（只用TIRF受一些限制）。但是實際應(yīng)用時,，大家可能會碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡,，但是無法使用共聚焦。為什么,？解釋一下：

首先,，熒光檢測必須有激發(fā)光照明，染料被特定波長的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種：1）白光（汞燈,、氙燈等）,，然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光。如檢測GFP時,，大家能看到藍光照射在樣品上,，因為GFP的激發(fā)條件是488nm 光。但是有一點,，顯微鏡不可能裝無限多的濾光片,，所以選擇是有限的。2）激光,，普通的激光器只能發(fā)射特定波長的光,，且數(shù)量有限，常見的是405,、488,、514、543,、633等,，所以可使用的染料也是有限。因此,，大家判定儀器能否滿足你實驗要求,，務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適。

其次,，在光檢測器（PMT,、CCD)前還有一塊濾光片，作用是反射樣品各種散射光,，只通過特定波長的熒光,，提高信噪比，得到干凈的背景,。因此，這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實驗要求（不用太擔(dān)心,，這個一般和激發(fā)濾光片配套,，不會有太多問題）。而在光譜型共聚焦里,，使用的是棱鏡或衍射光柵分光,，可以選擇通過任意需要的波段。這對使用量子點做標(biāo)記的同學(xué)特別有好處,！