由于具有高速度,、高分離效果,、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),，近年來,，HPLC的應(yīng)用發(fā)展非常神速,。目前,，幾乎所有需要分離的大分子有機(jī)物分析工作,，它都可以發(fā)揮優(yōu)勢?？梢灶A(yù)言,，HPLC儀器的應(yīng)用，將在“農(nóng),、輕,、重、海,、陸,、空，吃,、穿,、用”等各個(gè)領(lǐng)域、各行各業(yè)*,、無所不有,。
但是，如何用好HPLC是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題,?；谧髡叩拈L期實(shí)踐，以下從儀器學(xué)理論,、分析誤差理論,、分析化學(xué)等多個(gè)角度來全面討論,。

1、泵,、柱,、檢測器三者的關(guān)系的認(rèn)識和目前使用者普遍存在的問題

　　目前很多研發(fā)、使用HPLC的科技工作者,，沒有搞清楚或沒有*搞清楚HPLC中的泵,、柱、檢測器三者的關(guān)系,。國內(nèi)外很多生產(chǎn)廠商只是生產(chǎn)泵,、檢測器，色譜柱子都是外購件,。我們說HPLC是一個(gè)系統(tǒng),，是指泵、柱,、檢測器三者組成的一個(gè)完整的系統(tǒng),。如果只生產(chǎn)泵、檢測器,，就不能說是生產(chǎn)完整的HPLC儀器，只是生產(chǎn)了HPLC的兩種部件,，再買一根色譜柱組裝成一臺儀器后出售,。所以，這樣生產(chǎn)的HPLC系統(tǒng),，到了用戶那里,，總是不好用或者不大好用。而廣大使用者,，由于沒有將HPLC的泵,、柱、檢測器三者互相影響的關(guān)系搞清楚,，所以不能將HPLC用到 jia水平(得到誤差小的 jia分析檢測數(shù)據(jù)),。以本人長期的研發(fā)和使用HPLC的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為研發(fā),、使用HPLC時(shí),，以下問題特別值得注重：

　　正確認(rèn)識、處理HPLC的泵,、柱,、檢測器三者的關(guān)系：

　　(1) HPLC是一個(gè)系統(tǒng)，必須將泵,、柱,、檢測器三者(三個(gè)部件)結(jié)合起來才能叫HPLC,。三者都合格，聯(lián)機(jī)后的整機(jī)系統(tǒng)才有可能合格,，但不能肯定系統(tǒng)就會合格,。只有泵、柱,、檢測器三者質(zhì)量都合格,，并且聯(lián)機(jī)后檢測結(jié)果也合格，才能說明這臺HPLC是合格的,。

　　(2) 三個(gè)部件都重要,，不能偏重哪一方面。三者誰是核心?誰重要?目前,，光譜,、色譜工作者對此看法都各不相同、各有表述,，我們不必去追究這些,。作者認(rèn)為應(yīng)該說三者是一個(gè)整體，缺一不可,，都很重要,。

　　(3)本人長期使用過HPLC，也研發(fā)過HPLC儀器,，實(shí)踐使本人深深認(rèn)識到：必須將三個(gè)部件聯(lián)接起來檢驗(yàn)測試,，并能達(dá)到質(zhì)量指標(biāo)要求，才能說這臺HPLC達(dá)到了質(zhì)量要求,。否則,，只能說是部件合格，而整機(jī)系統(tǒng)不一 定能合格,。為什么? 因?yàn)椋?/p>

　?、俦脮?yàn)橹訂栴}產(chǎn)生壓力不穩(wěn)、流量不穩(wěn)定,，會影響HPLC系統(tǒng)的質(zhì)量;

　?、谥鶎Ρ糜绊懞艽螅褐氯⒅次?、柱接頭漏液等,，都會影響泵的壓力波動、使流速不穩(wěn)定,，會影響系統(tǒng)不穩(wěn),，使RSD變壞、峰拖尾,、靈敏度降低;

　?、壑鶎z測器影響很大：柱效降低(柱塔板數(shù)降低),、柱堵塞、柱的新舊程度,、接頭,、管道漏液等，都會影響檢測器的檢測限,、分辨率,、噪聲、和靈敏度,。

　　請注意：色譜柱是易損件,，用戶會經(jīng)常在色譜柱長時(shí)間使用后換新柱，此時(shí)HPLC系統(tǒng)的泵和檢測器基本進(jìn)入“電子元件失效理論”的盆底,，比較穩(wěn)定了,。所以，不會因?yàn)閾Q新柱而產(chǎn)生儀器不能使用的問題,。特別應(yīng)該指出的是：用戶換新柱后,，一般不檢測系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。如果檢測指標(biāo),，可能就不能達(dá)到原出廠指標(biāo)(因?yàn)楸煤蜋z測器經(jīng)過較長期使用后,，質(zhì)量會有所下降，舊泵,、新柱,、舊檢測器三者不能達(dá)到 jia配備)，但是不會影響使用,。

　　用戶換新柱不會影響使用的問題，可以從計(jì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范(JJG)得到佐證,。JJG檢驗(yàn)的儀器,，很多是在用儀器，它明確規(guī)定被檢儀器的指標(biāo)可以比新出廠的儀器指標(biāo)低,，甚至有些指標(biāo)因?yàn)檫_(dá)不到要求而免檢,。但我們的制造企業(yè)，在儀器出廠前,，必須檢測系統(tǒng)的指標(biāo),，只有系統(tǒng)指標(biāo)達(dá)到設(shè)計(jì)要求時(shí)，才算合格,，才能出廠,。至于用戶換新檢測器、換新泵,、同樣都是允許的,。
 

2,、使用者應(yīng)該對色譜柱及柱外的有關(guān)問題引起高度重視

　　1)色譜峰拖尾：與柱、流動相的流速,、試樣等有關(guān),，發(fā)現(xiàn)拖尾一定要從這些方面查找原因;

　　2)如何延長色譜柱壽命：保養(yǎng)很重要，長期不用時(shí)用甲醇浸泡著,，嚴(yán)格控制洗柱時(shí)間或洗柱溶劑體積,，一般經(jīng)常使用的柱，下班時(shí)應(yīng)該用甲醇(或水：甲醇為20：80)洗 45分鐘或20倍床體積;

　　3)必須注意對“柱外效應(yīng)”的控制,。所謂“柱外效應(yīng)”,就是指HPLC系統(tǒng)中,，除柱系統(tǒng)外，管路,、連接件,、進(jìn)樣器和流動池的死體積等引起的色譜峰增寬效應(yīng)。

　　4) 進(jìn)樣：自動進(jìn)樣時(shí),，應(yīng)該經(jīng)常檢測自動進(jìn)樣器,，對儀器進(jìn)樣器要求穩(wěn)定可靠;手動進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)該特別注意取樣時(shí)的細(xì)節(jié),，進(jìn)樣時(shí)的手感(輕,、重、緩,、急)等,。

3、HPLC的使用者應(yīng)該特別注重對色譜柱質(zhì)量的判斷

　　1)色譜柱的柱效：塔板數(shù)高者好,，特別要注意影響柱效的因素,，塔板數(shù)降到一定程度該柱就報(bào)廢了。

　　2)重復(fù)性：一根柱子反復(fù)使用時(shí),， haoRSD能夠保持小于0.1%,。

　　3)耐用性(壽命)：因?yàn)橹Ш苋菀捉档停孕枰匾晫χ谋Ｗo(hù),。

　　4)色譜柱使用后一定要進(jìn)行清洗,，以免造成腐蝕、阻塞,、降低塔板數(shù),。一般應(yīng)該用20倍床體積沖洗，隔幾天再用的HPLC,， hao用20%甲醇：80%水沖洗30分鐘左右后,，再用純甲醇沖洗20分鐘 后保存。

4、HPLC的使用者應(yīng)該特別重視流動相問題

　　1)PH值特別重要：一般C18柱PH小于3時(shí),，容易損壞色譜柱,，但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。

　　2) 注意選擇試劑的截止波長：如乙腈截止波長215nm,、丙酮截止波長330nm,、正丁烷210nm等等(具體情況請讀者參閱本文的參考文獻(xiàn))。

　　3)流速：流速要適當(dāng),，否則影響峰形,、浪費(fèi)溶劑，一般常規(guī)分析工作大多選擇1ml/min,。

5,、使用者應(yīng)該注重溶劑前處理

　　 hao使用HPLC級的優(yōu)質(zhì)溶劑，使用前必須過濾和脫氣,。注意以下幾點(diǎn)：

　　1)過濾目的：

　　溶劑進(jìn)泵前和樣品注射前應(yīng)該過濾除去溶劑中的微小顆粒,、微生物，保證泵和色譜柱不會堵塞或損壞,，保證分析數(shù)據(jù)可靠,。

　　2)對過濾器的要求和 jia孔徑選擇方法：

　　對過濾器總的要求：速度快、溶出度小,、死體積小,、精 que的孔徑、體積適當(dāng),、化學(xué)兼容性好等,。

　　 jia孔徑選擇方法：如果色譜柱填料直徑小于3µm或除菌過濾，一般選擇0.2µm孔徑;如果色譜柱填料直徑大于5µm,，則選0.45µm;如果是預(yù)過濾或過濾難過濾的樣品,，一般選1µm孔徑。特別是對使用無機(jī)鹽配制的緩沖液,，更要注意選擇合適的過濾器!否則,，不可能得到可靠的分析測試數(shù)據(jù)!

　　3)脫氣：

　　主要目的是：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡。液相色譜流動相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣,、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。流動相的氣泡進(jìn)入液相泵會引起壓力的上下波動,，危害很大,，必須除之，可以打開排空閥,，大流速沖洗,。

6、使用者應(yīng)該注重緩沖液問題

　　1) 緩沖液使用前必須過濾。

　　2) 溶劑,、樣品易受到細(xì)菌和霉菌的影響,，要注意清潔。

　　3)一般不能直接用有機(jī)溶劑做清洗沖洗,。

　　4)梯度洗脫時(shí),，選低吸收值的緩沖液 ：

　　例如：梯度洗脫時(shí)，緩沖液與有機(jī)相應(yīng)預(yù)混,，以防止析鹽,。在保證峰不拖尾的情況下，盡可能選用低濃度的緩沖鹽,，防止析鹽; 緩沖鹽濃度,，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流動相中有機(jī)相含量高的話,，流動相中的鹽類緩沖液濃度就不能過高,，鹽的濃度起碼要保證在流動相條件下不會析出。離子對緩沖液濃度要高一點(diǎn),，一般50～100mM,。

7、研發(fā)者,、使用者還特別需要重視12個(gè)常見的技術(shù)問題,。

　　這12個(gè)問題是作者的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，是用好HPLC的科技工作者必須重視的問題,。(請讀者參考《李昌厚,，高效液相色譜儀器及其應(yīng)用，北京：科學(xué)出版社,，2014》一書),。

8、使用者必須重視進(jìn)樣器的清洗問題

　　進(jìn)樣器或進(jìn)樣針請注意三點(diǎn)：

　　A,、對進(jìn)樣器要求：自動進(jìn)樣和取樣速度快,、有些儀器進(jìn)樣時(shí)間僅17秒。

　　B,、進(jìn)樣室要求可控:一般用帕爾帖冷卻,，溫控范圍4℃～100℃。

　　C,、特別要應(yīng)注意進(jìn)樣殘留量的清洗(主要是清洗針),。
 

9、使用者應(yīng)該重視HPLC的線性動態(tài)范圍(Linear Dynanic Range-LDR)及其測試方法

　　1)線性動態(tài)范圍的定義
       上科技工作者對HPLC的線性動態(tài)范圍的定義是：大線性區(qū)(保證1%相對誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)_max,，除以小線性區(qū)(保證1%相對誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)min,。即LDR=A_max/A_min;或大線性區(qū)的濃度C_max除以小線性區(qū)的濃度C_min，即LDR=C_max/C_min。

　　2)HPLC的線性動態(tài)范圍的重要性(對分析測試誤差的影響)

　　定量分析檢測時(shí),，如果HPLC使用在非線性動態(tài)區(qū),，肯定會因非線性而產(chǎn)生誤差。為了保證分析測試結(jié)果的可靠性,，我們應(yīng)使用在HPLC的線性動態(tài)區(qū),。因此，線性動態(tài)范圍是一切HPLC使用者必須高度重視的技術(shù)指標(biāo),。

　　一般來說,，使用者拿到一臺HPLC儀器后，總是希望對很稀的樣品分析時(shí),，其分析測試的結(jié)果在所要求的誤差范圍內(nèi),。對很濃的樣品分析時(shí)，其分析測試的結(jié)果也在所要求的誤差范圍內(nèi),。這就只有HPLC的線性動態(tài)范圍很寬的時(shí)候才能做到,。有人認(rèn)為，樣品太稀時(shí),，濃縮一下就好了,，樣品太濃時(shí)，稀釋一下就是了,。這是不了解分析工作或未親自作過分析工作的人說的話,。因?yàn)椋瑵饪s一下或稀釋一下談何容易?首先是增加工作量,，稀釋或濃縮工作很麻煩;第二,，稀釋或濃縮會帶來誤差。所以我們總是希望HPLC的線性動態(tài)范圍大(寬)且好,。

　　HPLC的線性動態(tài)范圍,，一般取決于儀器檢測器的噪聲和雜散光。國內(nèi)外很多HPLC的生產(chǎn)廠商不給出HPLC的線性動態(tài)范圍,。作者認(rèn)為不給線性動態(tài)范圍是不對的,，因?yàn)椴唤o線性動態(tài)范圍，就意味著不知道這臺HPLC分析的樣品濃度的上限和下限,。綜上所述,，HPLC的線性動態(tài)范圍非常重要，它將限制儀器的使用范圍(即限制儀器的適用性),。很遺憾的是許多科技工作者目前還未對線性動態(tài)范圍引起重視,。

　　3)線性動態(tài)范圍測試方法

　　HPLC的線性動態(tài)范圍的測試方法有多種。我國的計(jì)量檢定規(guī)程JJG705-2002規(guī)定：波長254nm時(shí),，采用“丙酮/2%異丙醇水溶液(丙酮含量為0.1%、0.2%、....1.0%)沖洗檢測池,，并記下各溶液對應(yīng)的穩(wěn)定記錄儀讀數(shù);由C_H/C_L算出檢測器的線性范圍(C_H濃度上限,、C_L濃度下限)。”作者認(rèn)為這種方法很不妥,。因?yàn)闈舛鹊南孪奘怯?jì)算出來的,，不是真正測試出來的下限。采用的計(jì)算公式為：C_L=2NCV/H×20(公式本身有錯(cuò)誤);并且算出的下限值達(dá)到千萬分之三點(diǎn)一(即：0.000031%),。這樣的數(shù)據(jù)有什么意義?作者認(rèn)為這種測試線性范圍的測試方法既不符合儀器學(xué)理論,，又不與接軌，有關(guān)部門應(yīng)該盡快更正,。

　　目前,，上對線性動態(tài)范圍的測試方法，一般是配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品(以數(shù)量級遞增),，直接在儀器上測試其吸光度,。求出偏離比耳定律1%時(shí)的大吸光度A_max和小吸光度A_min。二者相除即是儀器的線性動態(tài)范圍LDR(Linine Dinamic Rangi),。即LDR=A_max/A_min,。其具體操作是：HPLC儀器設(shè)置縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為濃度C;檢測器的光譜帶寬為2nm;波長設(shè)置可以在紫外區(qū)(如要求很高時(shí)可設(shè)置在253.7nm),，也可在可見區(qū)(如500nm);試樣可任選,，濃度從小到大，依次對所配試樣進(jìn)行測試,。作曲線,，從曲線上找出偏離線性在1%以內(nèi)的范圍。此范圍內(nèi)的A_max/A_min就是線性動態(tài)范圍,。

　　作者在研發(fā)HPLC的UV/FLD時(shí),，就是根據(jù)儀器學(xué)理論，從線性動態(tài)范圍的物理概念出發(fā),，自己配置蒽不同濃度的溶液,，以數(shù)量級遞增，測出能保證1%相對誤差的下限點(diǎn)和上限點(diǎn),，二者相除,，得出其線性動態(tài)范圍，效果非常好,。