本試劑盒用于體外定性檢測血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3),。

有效期：6個(gè)月

保存條件：2-8℃

本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷

實(shí)驗(yàn)原理

試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、陰性和陽性對(duì)照、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的大鼠呼腸孤病毒III型(Reo-3)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，判定陰陽性,。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

需要而未提供的試劑和器材

1.  酶標(biāo)儀（450nm）

2.  高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL

3.  37℃恒溫箱

4.  蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

名稱 96孔配置 48孔配置 備注

微孔酶標(biāo)板 96孔 48孔 無

陰性對(duì)照 0.3mL 0.3mL 無

陽性對(duì)照 0.3mL 0.3mL 無

樣本稀釋液 6mL 3mL 無

檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋

底物A 6mL 3mL 無

底物B 6mL 3mL 無

終止液 6mL 3mL 無

封板膜 2張 2張 無

說明書 1份 1份 無

自封袋 1個(gè) 1個(gè) 無

注意事項(xiàng)

1.  嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑,。

2.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3.  消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

4.  底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用,。

5.  避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。

6.  在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7.  平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

8.  任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9.  不能使用過期產(chǎn)品,。

10.  如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置陰性對(duì)照孔,、陽性對(duì)照孔和樣本孔,，陰性、陽新對(duì)照孔各加50μL對(duì)照品,；

3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。

4.  除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

1. 陰性對(duì)照OD值：小于0.2。

2. 陽性對(duì)照OD值：大于0.8,。

3. 陽性判斷（Cut-Off值）：陰性對(duì)照OD值+0.15,，樣本OD值大于閾值，判定為陽性,，反之,，為陰性。