人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定實(shí)驗(yàn)室：

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 1 主要儀器及試劑倒置顯微鏡( Olympus,，日本) ,，二氧化碳培養(yǎng)箱( Thermo,，美國(guó)) ,，超凈工作臺(tái)( 博科生物) ,，移液器( Eppendorf,，德國(guó)) ,，染色體核型分系統(tǒng)( Cytovision,，AI,，UK) ，流式細(xì)胞儀( BD,，美國(guó)) ,，胎牛血清( FBS，Gibco) ,，L － DMEM( Invitrogen) ,，青/鏈霉素，Antibiotic( Invitrogen) ,， IV型膠原酶( Collagenase IV,，Gibco ) ，Dispase Ⅱ( Roche) ,，L － 谷氨酰胺( Invitrogen) ,，鼠抗人單克隆抗體IgG2a － FITC， IgG1 － PE,，CD29 － PE,，CD34 －PE，CD44 － FITC,，CD105 － FITC( 均為BD 公司生產(chǎn)) ,，植物細(xì)胞凝集素( Phaseolus vulgaris agglutinin

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離剪取胎盤絨毛膜面1 ～ 2cm 厚的組織，剪成1mm × 1mm × 1mm 的碎塊,，用PBS 漂洗至無(wú)色,，用240U·mL － 1 DispaseⅡ和270U·mL － 1 Collagenase IV 37℃ 水浴消化1h,，振蕩后靜置1min，使液體自然分為三層,，吸取中間層懸液于離心管中,，加入PBS，搖勻后700r·min － 1離心5min,，棄上清,，加入3mL 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀，700r·min － 1 離心5min,，棄上清,。加入適量培養(yǎng)液混勻，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 2 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞的繼代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),，進(jìn)行胰酶消化傳代,。傳代時(shí)，以0. 25% 胰蛋白酶消化3 ～ 4min,，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化,，700r·min － 1離心10min，棄消化液,，加入細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻,，收集細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，置于37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 3 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞特異性抗原的鑒定選取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的第三代及凍存復(fù)蘇后正常生長(zhǎng)中的胎盤間充質(zhì)細(xì)胞,，用0. 25% 胰蛋白酶消化后,，收集細(xì)胞懸液于離心管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 105·μL － 1 ; 取6 只試管,，每管分別加15μL鼠抗人單克隆抗體CD29 － PE、CD34 － PE,、CD44 －FITC,、CD105 － FITC，以鼠抗人IgG2a － FITC,、IgG1 － PE 作為陰性對(duì)照,，再分別加入150μL 細(xì)胞懸液混勻，室溫避光放置10min,，之后再用PBS 洗2次,，流式細(xì)胞儀檢測(cè),，Cellquest 軟件獲取與分析。

1. 2. 4 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞染色體核型分析用秋水仙素( 終濃度為0. 05μg·mL － 1 ) 分別處理第二代和第十四代的胎盤間充質(zhì)細(xì)胞2h 后收集細(xì)胞,，用0. 075mol·L － 1 的KCl 溶液5mL 低滲處理細(xì)胞30min,，固定、制片,。將制片標(biāo)本置65℃烘烤3h,，室溫存放3 ～ 7d。37℃ 0. 25% 胰蛋白酶溶液中預(yù)處理10 ～ 20s,，然后用GKN 液和自來(lái)水依次漂洗數(shù)秒,，立即用Giemsa 染液染色10 ～ 15min，封片,，顯微鏡下觀察并作染色體核型分析,。