上海通蔚生物的夾心 ELISA 測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原,。目標(biāo)抗原必須包含至少兩個能夠結(jié)合到抗體的抗原表位,。夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）,。

單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統(tǒng)中用作捕獲抗體和檢測抗體,。單克隆抗體識別單一表位,，可對抗原中微小差別進(jìn)行定量檢測,。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

操作步驟：

用捕獲抗體包被

1. 用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH 9.6) 中濃度為 1–10 μg/mL 的捕獲抗體包被 PVC 微量滴定板的樣品孔,。

如果使用未純化抗體（例如腹水或抗血清）,，可能需要提高樣品蛋白質(zhì)的濃度（嘗試 用10 μg/mL）來補償較低濃度的特異性抗體。

2. 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在 4 ℃ 下孵育過夜,。

3. 棄去包被液,，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μL PBS,。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板,，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板,，除去剩余的液滴,。

封閉和加樣

1. 每孔添加 200 μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點,。

2. 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 1-2 小時,，或在 4 ℃ 下孵育過夜。

3. 用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次,。

4. 每孔添加 100 μL 經(jīng)過稀釋的樣品,。通常將未知樣品的信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號進(jìn)行比較。每個板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測定或三重測定）和空白樣,。在 37 ℃ 下孵育 90 分鐘,。

5. 棄去樣品，用 200 μL PBS 洗滌微量滴定板兩次,。

我司確保標(biāo)準(zhǔn)品的濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動態(tài)檢測范圍,。可能需要優(yōu)化濃度范圍以確保獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品通常采取兩重測定或三重測定,。

檢測抗體和二抗孵育

1. 每孔添加 100 μL 經(jīng)過稀釋的檢測抗體。

確保檢測抗體識別與捕獲抗體不同的靶蛋白上的表位,。這能避免抗體結(jié)合受到干擾,。盡可能使用已測試的匹配抗體對。

2. 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時,。

3. 用 PBS 洗滌微量滴定板四次,。

4. 添加 100 μL 偶聯(lián)二抗，其在使用之前便用封閉緩沖液進(jìn)行稀釋,。

5. 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 1-2 h,。

6. 用 PBS 洗滌微量滴定板四次,。

檢測辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 分析中使用的兩種酶，例如肺泡細(xì)胞中的高水平 ALP,、紅細(xì)胞中的高水平過氧化物酶）,，這可能會導(dǎo)致非特異性信號。如有必要,，用左旋咪唑（針對 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（針對過氧化物酶）進(jìn)行另外的阻斷處理,。