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介紹                                                

通常從人體活檢中采集并保存福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本,，用于組織學(xué)研究。福爾馬林固定法通過將核酸和蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)容物交聯(lián)并將樣品包裹在蠟中,，使材料可在室溫下保存多年,。世界各地的生物中心和研究人員儲存了數(shù)以百萬計(jì)的FFPE樣本。

隨著文庫準(zhǔn)備和下一代測序技術(shù)的進(jìn)步,，這些樣本中保存的核酸現(xiàn)在可以被恢復(fù),，以產(chǎn)生重要的基因組信息。因此,，存檔的FFPE樣品成為了豐富而珍貴的研究材料來源,。越來越多的研究實(shí)驗(yàn)室利用zinq FFPE樣本來分析和了解與疾病相關(guān)的基因和突變多種因素導(dǎo)致了從FFPE分離出的DNA質(zhì)量的變化，包括保存過程中發(fā)生的核酸化學(xué)變化,，保存過程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,，以及存檔樣本的年齡。從FFPE樣本中分離出的DNA質(zhì)量較低,，有望產(chǎn)生低復(fù)雜度的NGS文庫,，因?yàn)楸M管分離出的DNA有明顯的濃度，但DNA的“可用”量很低為了創(chuàng)建具有大多樣性的庫,，選擇正確的庫準(zhǔn)備方法是至關(guān)重要的。ThruPLEX technoloqy使用莖環(huán)適配器,，這樣就不需要中間的清理步驟,，維持單管工作流程，并保持庫的復(fù)雜性,。后的擴(kuò)增利用了所有修復(fù)和連接的分子,，結(jié)果在文庫中發(fā)現(xiàn)了大量的*分子(Fiqure 1)。另一個(gè)好處是,，創(chuàng)建文庫的時(shí)間減少到大約兩小時(shí),。ThruPLEX DNA-seq庫也可以很容易地與其他應(yīng)用程序集成，如目標(biāo)富集,。輸入材料的高度多樣性保證了捕獲將產(chǎn)生文庫的優(yōu)良覆蓋整個(gè)基因組的目標(biāo)區(qū)域

 Fiqure 1.采用ThruPLEX技術(shù),。這個(gè)工作流程使用了一個(gè)三步單管反應(yīng)，開始的片段雙鏈DNA,，經(jīng)過一個(gè)高效的修復(fù)過程,。接下來,，莖環(huán)適配器被鈍端連接到修復(fù)的輸入DNA上。使用高保真聚合酶對這些分子進(jìn)行擴(kuò)展和擴(kuò)增,，使其包括條形碼,，從而生成索引化的Illumina NGS庫。

 在本技術(shù)說明中,，我們演示了我們的通用文庫準(zhǔn)備試劑盒——ThruPLEX DNA-seg試劑盒與ffpe衍生的DNA一起使用時(shí)的性能和特點(diǎn),。對于非FFPE樣本，標(biāo)準(zhǔn)方案建議的輸入范圍為0.05-50 ng,，在此,，我們將輸入量增加到100 ng，以補(bǔ)償FFPE樣本中受損的DNA,。我們的結(jié)果表明,，在Ilumina平臺上從ffpe提取的DNA中制備NGS文庫時(shí)，ThruPLEX DNA-seq技術(shù)是一個(gè)很好的選擇,。與其他庫準(zhǔn)備工具包相比,，它提供了更多樣化的庫，同時(shí)小化了GC偏差,。我們進(jìn)一步演示了ThruPLEX DNA-Seq試劑盒如何與Agilent SureSelect富集試劑盒成功集成,，對FFPE樣品進(jìn)行靶向測序。

 結(jié)果                                                

ThruPLEX DNA-seg技術(shù)生產(chǎn)的文庫比NEB Next Ultra或KAPA Hyper試劑盒更具多樣性,。平均而言,，ThruPLEX library產(chǎn)生的估算庫大小比NEB Next Ultra大80%，比KAPA Hyper大240%,，表明ThruPLEX library中存在更多的*分子(圖2),。正如預(yù)期的那樣，ThruPLEX DNA-seq產(chǎn)生的重復(fù)讀取不到2%,。與NEBNext Ultra相似,，而KAPA Hyper的重復(fù)reads范圍大(3-6%)(圖2)。對文庫分子插入量的檢查顯示,，ThruPLEX DNA-Sea試劑盒產(chǎn)生的插入量為190 bp,。大約相當(dāng)于KAPA Hyper庫，但比NEBNext Ultra的150-bp插入長約27%(圖2),。在對配對端讀取時(shí),，插入長度越長往往越有利，因?yàn)橛懈嗟牟恢丿B讀取,，可以更好地表示原始序列信息,。

 圖2. 高度多樣化的庫。與其他測試試劑盒相比,，ThruPLEX DNA-seq文庫提供了更多*的分子(上圖)和更少的重復(fù)(上圖),。下圖:ThruPLEX DNA-seq創(chuàng)建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra長-27%,。比較了三種試劑盒制備的文庫的GC覆蓋率。ThruPLEX DNA-Seg試劑盒產(chǎn)生了平衡的GC覆蓋率(圖3),。

圖3. 均一的GC的覆蓋度,。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文庫覆蓋了整個(gè)人類基因組。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板對ThruPLEX DNA-seg文庫進(jìn)行富集,。在每種情況下,，庫的質(zhì)量都很高，如圖4中的數(shù)據(jù)所示,。通過測序深度測量的Kinome覆蓋率與樣本有關(guān),，并在目標(biāo)面板覆蓋40-50X的情況下進(jìn)行測序。所有樣品上餌覆蓋率均大于70%

圖4. 使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板豐富了ThruPLEX DNA-seq文庫的目標(biāo)測序指標(biāo),。

 結(jié)論                                                

FFPE樣本的序列可能非常具有挑戰(zhàn)性,。在固定過程中引入的不同程度的化學(xué)損傷減少了可用于構(gòu)建文庫的“優(yōu)質(zhì)”材料的數(shù)量。為此,，在這一系列實(shí)驗(yàn)中,，我們修改了標(biāo)準(zhǔn)的ThruPLEX DNA seq協(xié)議，將輸入量增加到100ng,。這使我們能夠創(chuàng)建更多樣化的庫(庫復(fù)雜性高80-240%),，并且比其他庫準(zhǔn)備試劑盒包含更少的擴(kuò)增。

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