內(nèi)毒素致病性Pfeiffer于十九世紀(jì)首先提出“內(nèi)毒素”一詞,,研究表明,內(nèi)毒素在機(jī)體內(nèi)作用于單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子TNF,,白細(xì)胞介素IL,,干擾素Interferon,凝血素等),。當(dāng)這些因子在機(jī)體內(nèi)過(guò)量時(shí),,則可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓,、休克,、多器官功能衰竭甚至死亡,。 因此,,人和動(dòng)物的注射藥物、生物制品和醫(yī)療器械的終端產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的檢測(cè)和去除顯得尤為重要,。 內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一部分,,其主要成分為脂多糖(LPS),經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞裂解后釋放出來(lái),。LPS可以分為三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:特異性O(shè)鏈,、核心寡聚糖和類脂A,如下圖所示: 內(nèi)毒素特性- 性質(zhì)穩(wěn)定:160℃的溫度下加熱2-4個(gè)小時(shí),,或用強(qiáng)堿,、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加熱煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性。
- 經(jīng)甲醛溶液處理后,,可降低其毒性,,但不能成為類毒素。
中國(guó)藥典(CP)規(guī)定,,藥品,、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定: L=K/M 式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值,以EU/ml,、EU/mg或EU/U(活性單位)表示,; K為人每公斤體重每小時(shí)大可接受的內(nèi)毒素劑量,以EU/(kg• h)表示,,注射劑K=5 EU/(kg• h),,放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg• h),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg• h); M為人用每公斤體重每小時(shí)大劑量,,以ml (kg• h),、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示,人均體重按60 kg計(jì)算,,人體表面積按1.62 m2計(jì)算,,注射時(shí)間若不足1小時(shí),按1小時(shí)計(jì)算,。 按人用劑量計(jì)算限值時(shí),,如遇特殊情況,可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整,,但需說(shuō)明理由,。 美國(guó)藥典(USP)規(guī)定,非經(jīng)腸道藥品的內(nèi)毒素限值,,以劑量定義,,等于:K/M。 除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑,,K均為5 USP-EU/kg,,鞘內(nèi)給藥時(shí),K為0.2 USP-EU/kg,,對(duì)于非鞘內(nèi)給藥放射性藥品,,內(nèi)毒素限值的計(jì)算為175/V,V為以ml為單位的大推薦劑量,,對(duì)于鞘內(nèi)給藥的放射性藥品,,其內(nèi)毒素限值為14/V,對(duì)于按以每平方體表面積計(jì)算的給藥劑量(通常是抗腫瘤藥品),,計(jì)算公式為K/M,,其中K=5 EU/kg,M為(大劑量/m2/小時(shí)×1.80m2)/70kg,。 檢測(cè)方法的建立:1968年,,由Leivin和Bang發(fā)現(xiàn)并建立了利用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。他們發(fā)現(xiàn),,當(dāng)遇到內(nèi)毒素時(shí),,鱟的血液能夠凝結(jié)成塊。用鱟血液中的變形細(xì)胞提取物與待檢樣品混合,,如果待檢樣品中含有內(nèi)毒素,,則會(huì)觀察到上述情況。鱟試驗(yàn)法(LT)已經(jīng)替代了熱原檢查家兔法檢驗(yàn)藥品中的內(nèi)毒素,。 目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了以下LAL檢測(cè)法:凝膠法(ToxinSensorTM凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒),、濁度法和顯色法(ToxinSensorTM顯色法LAL內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒),。 半定量測(cè)定——凝膠法 通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)半定量?jī)?nèi)毒素的方法,是各國(guó)藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法,。 定量測(cè)定——濁度法和顯色法 濁度法(動(dòng)態(tài)濁度法和終點(diǎn)濁度法)是通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法,。終點(diǎn)濁度法是基于細(xì)菌內(nèi)毒素濃度和反應(yīng)混合物的終點(diǎn)濁度( 吸收度或透光率) 之間的定量關(guān)系的一種檢測(cè)方法;動(dòng)態(tài)濁度法(又稱動(dòng)態(tài)比濁法)是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度上升某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間,,或是檢測(cè)濁度增加速度的方法,。 顯色法(動(dòng)態(tài)顯色法和終點(diǎn)顯色法)是將鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng),可使特定底物顯色,,通過(guò)釋放出的呈色團(tuán)的多少來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量,,又稱為比色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法,。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間, 或檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的方法,。 內(nèi)毒素檢測(cè)方法的選擇: 凝膠法——僅需檢測(cè)樣品的內(nèi)毒素*。此法操作比較簡(jiǎn)單,、經(jīng)濟(jì),,不需要測(cè)定設(shè)備,可進(jìn)行定性或半定量測(cè)定,。 顯色法(或濁度法)——定量測(cè)定樣品中內(nèi)毒素含量,。 - 日常檢測(cè)量不大時(shí),可以選擇終點(diǎn)顯色法,,用普通的分光光度計(jì)就可完成實(shí)驗(yàn),。
- 檢測(cè)的樣品是生物制品、疫苗,、血液制品等選用終點(diǎn)顯色法或動(dòng)態(tài)顯色法。
- 檢測(cè)量比較大,,檢測(cè)的樣品對(duì)鱟試劑的干擾不大,,可選用動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑。
注:動(dòng)態(tài)濁度法與動(dòng)態(tài)顯色法需要帶溫育系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)光度測(cè)定儀器及配套軟件,。
華雅思創(chuàng)生物提供定量和定性產(chǎn)品如下: 凝膠定性: LONZA 凝膠法鱟試劑檢測(cè)法: 品牌 | 產(chǎn)品描述 | 貨號(hào) | 靈敏度EU/mL | 包裝 | LONZA | PYROGENTTM Plus 凝膠法鱟試劑檢測(cè)(含對(duì)照),單管內(nèi)毒素對(duì)照品1x1mL24次,,單管 | N289-06 | 0.06 | 24次 | N289-125 | 0.125 | N289-25 | 0.25 | LONZA | PYROGENTTM Ultra 凝膠法鱟試劑檢測(cè)(含對(duì)照) 內(nèi)毒素對(duì)照品5x5mL 200次=4X50次/管 | N594-03 | 0.03 | 200次 | N594-06 | 0.06 | N594-125 | 0.125 |
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顯色法或濁度定量法: 品牌 | 貨號(hào) | 產(chǎn)品描述 | 靈敏度EU/mL | 包裝 | LONZA | N383 | PYROGENTTM -5000動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè) | 0.01-100 | 100次 | LONZA | N384 | 200次 | LONZA | 50-650U | Kinetic-QCLTM 動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑檢測(cè) | 0.005-50 | 192次 | LONZA | 50-640 | PyroGeneTM 重組因子C熒光法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑 | 0.005-5 | 192 |
輔助試劑耗材: 品牌 | 貨號(hào) | 產(chǎn)品描述 | 包裝 | LONZA | N186 | 凝膠法內(nèi)毒素對(duì)照品(E.Coli Strain 055:B5) | 5瓶 | LONZA | E50-640 | 終點(diǎn)顯色法內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(Strain 0111:B4) | 1瓶 | LONZA | W50-640 | 無(wú)內(nèi)毒素水,,靈敏度<0.005 EU/mL | 30mL | LONZA | W50-100 | 100mL | LONZA | W50-500 | 500mL | LONZA | N207 | 13X100mm無(wú)內(nèi)毒素玻璃稀釋管,箔紙包裝,,無(wú)瓶蓋 | 50/包 |
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