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直接對(duì)生物樣品代謝組快速分析的工具：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜儀
LTQ-Orbitrap組合質(zhì)譜作為一個(gè)快速分析工具可以對(duì)直接注入的生物樣品的代謝組進(jìn)行研究。這個(gè)理念的一個(gè)有利的證據(jù)是通過(guò)流動(dòng)注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中,，整個(gè)實(shí)驗(yàn)采樣時(shí)間只有3分鐘,。一張典型的質(zhì)譜圖有幾千個(gè)質(zhì)荷比信號(hào)，其中400個(gè)是與分析相關(guān)的(即：在相同試驗(yàn)條件下,，他們的信號(hào)強(qiáng)度比背景噪聲高3倍以上且至少有60%獲取的輪廓圖與之相關(guān)),。該方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗(yàn)證,。Orbitrap質(zhì)譜的質(zhì)量測(cè)量可以區(qū)分同重的離子,，而且可以對(duì)感興趣的離子進(jìn)行元素組成進(jìn)行分析和鑒定且質(zhì)量誤差在5ppm以下。通過(guò)線性離子阱的多級(jí)質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)譜對(duì)子離子的質(zhì)量測(cè)定,，可以推測(cè)可能結(jié)構(gòu),。當(dāng)我們將該方法用于鎘的毒性研究時(shí)，它與zui初開(kāi)發(fā)用于目標(biāo)分析的液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜方法取得了相同的效果。用多元統(tǒng)計(jì)分析也得到了相同的代謝指紋圖譜,。該結(jié)果表明在鎘存在的情況下氨基酸的代謝發(fā)生了改變,，增加了谷胱甘肽的合成。
因?yàn)轱w行時(shí)間質(zhì)譜和四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜具有很高的掃描速率,，所以他們也非常適合對(duì)樣品進(jìn)行全面分析,。在內(nèi)標(biāo)校正下能得到質(zhì)量數(shù)小于5ppm的高分辨率。在質(zhì)量分辨率8000-12000可以將同重離子分開(kāi),。 (m/¢m,， FWHM，即zui大半峰寬),。
雖然通過(guò)減少離子抑制和通過(guò)保留時(shí)間,，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù),，二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)化合物鑒定是有用的,，但是色譜分離影響被分析代謝指紋圖譜的信息量，因?yàn)槿鄙偃魏我环N固定相可以對(duì)代謝組中具有多樣性的化學(xué)組分實(shí)現(xiàn)*分離,。結(jié)果,，至少需要兩個(gè)色譜分析系統(tǒng)用于研究整個(gè)代謝組譜圖。 此外,，在多變量和單變量的數(shù)據(jù)分析方法學(xué)(背景噪聲抑制和色譜峰調(diào)整比對(duì)) 之前的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理仍然存在問(wèn)題,。一些分析相關(guān)的質(zhì)荷比信號(hào)會(huì)被排除，在對(duì)背景噪音消除過(guò)程中和對(duì)保留時(shí)間漂移的的校正時(shí)可能產(chǎn)生人為的假象,。在本文中,，在沒(méi)有任何前期的色譜分離步驟將生物樣品直接注入質(zhì)譜儀里對(duì)代謝組研究將是一個(gè)具有吸引力的選擇。
雖然直接注射質(zhì)譜分析(DIMS)已經(jīng)用低分辨質(zhì)譜或飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行了研究,，但是超高質(zhì)量分辨率儀器例如傅立葉變換離子回旋共振(FTICR)質(zhì)譜儀是上述方法的又一選擇,。通過(guò)在質(zhì)譜圖上的質(zhì)量數(shù)（亞ppm級(jí)的誤差）可以提供低分子量物質(zhì)(即分子量在1000以下)的元素組成，這無(wú)疑可以區(qū)分同重離子,。盡管具有相似質(zhì)量數(shù)代謝物不能被區(qū)分的,，但可以通過(guò)色譜分離實(shí)現(xiàn)辨別。也可以用各種活化模式進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析來(lái)實(shí)現(xiàn)分辨,。如對(duì)于荷正電的單電荷和多電荷可用持續(xù)失諧衰減輻射碰撞誘導(dǎo)解離和紅外多光子裂解,，對(duì)于帶多質(zhì)子離子進(jìn)行電子捕獲裂解和電子轉(zhuǎn)移解離裂解，對(duì)于帶多個(gè)負(fù)電的離子用EDD進(jìn)行裂解,。實(shí)現(xiàn)對(duì)子離子的質(zhì)荷比進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定,。然而，由于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR)在高強(qiáng)磁場(chǎng)下和昂貴費(fèi)用才能運(yùn)轉(zhuǎn),，而且常需要長(zhǎng)時(shí)間優(yōu)化,，故目前沒(méi)有普遍使用。如今，這個(gè)問(wèn)題被zui近出現(xiàn)的超高分辨率LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜所解決,。 該設(shè)備的前面部分是一個(gè)線性離子阱(二維離子阱),，它能記錄一級(jí)質(zhì)譜和來(lái)自前提離子選擇的多級(jí)質(zhì)譜圖。與傳統(tǒng)的三維離子肼相比,，線性離子肼能提供更好的動(dòng)態(tài)范圍,，較低的低質(zhì)量截止點(diǎn)，以及由于電子云分布在軸上而不是三維中心上故有較低的空間電荷效應(yīng),，因此提高了靈敏度,。離子在被注入到Orbitrap質(zhì)量分析器中首先被C肼短暫累積。離子不是通過(guò)錘型磁場(chǎng)捕捉,，而是儲(chǔ)存在由軸式中心電極和共軸外電極形成的靜電場(chǎng),。通過(guò)傅里葉變換過(guò)程得到不同質(zhì)荷比離子的震蕩頻率，可以準(zhǔn)確讀取質(zhì)荷比,。Orbitrap質(zhì)量分析器得到的瞬時(shí)信號(hào)與中心電極軸運(yùn)動(dòng)有關(guān),，是由于傅里葉回旋共振儀器的輻射回旋運(yùn)動(dòng)引起的。本文的研究目的是在質(zhì)譜檢測(cè)前沒(méi)有任何色譜系統(tǒng)分離的情況下,，用LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜快速對(duì)代謝指紋圖譜構(gòu)建進(jìn)行評(píng)價(jià),。目前為止, 這個(gè)理念的一個(gè)有利的證據(jù)是對(duì)酵母細(xì)胞提取物進(jìn)行了研究。通過(guò)流動(dòng)注射進(jìn)樣,，基于直接進(jìn)樣的方法,，我們發(fā)展了該方法并進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí),，報(bào)道了代謝物鑒定的方法,。然后將該方法應(yīng)用于受鎘毒害情況下酵母的代謝反應(yīng)。在*種目標(biāo)分析方式下,，從代謝指紋圖譜中提取生物相關(guān)的離子,，并與三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。在全局代謝組分析方式下,，通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)分析得到相同的代謝指紋圖譜,。
結(jié)論：
我們發(fā)展了能夠快速對(duì)代謝組指紋圖譜的一個(gè)新方法。它基于將生物樣品直接注入一臺(tái)新型雜交質(zhì)譜儀：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜,。這個(gè)理念的一個(gè)有利的證據(jù)是通過(guò)流動(dòng)注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中,。在Orbitrap質(zhì)譜儀中的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)可以分辨同重離子，可以給出目標(biāo)離子和子離子的元素組成且誤差范圍小于5ppm,。通過(guò)線性離子肼的多級(jí)質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)量分析器對(duì)子離子準(zhǔn)確質(zhì)量的測(cè)定可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè),，雖然缺乏色譜分離而且是在低分辨的線性離子肼內(nèi)對(duì)母離子進(jìn)行選擇，但是本研究表明有可能通過(guò)子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)量分辨出同重離子,，有可能通過(guò)裂解方式不同區(qū)分同分異構(gòu)體,。
該方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng),、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗(yàn)證。 雖然方法的靈敏度受基質(zhì)效應(yīng)的影響,，卻是色譜方法的一種有競(jìng)爭(zhēng)力的選擇,，色譜方法有費(fèi)時(shí)，耐用性不好,，需要批間比對(duì)和數(shù)據(jù)處理等諸多缺點(diǎn)（即背景噪音抑制,，不同色譜圖保留時(shí)間漂移的校正）
當(dāng)研究鎘對(duì)酵母毒性時(shí)，雖然液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜的精密度比DIMS更高,，但是DIMS能得到與液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜相似的結(jié)果,。雖然DIMS不如液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜靈敏，但是卻能檢測(cè)大多數(shù)代謝物,。同一代謝指紋圖譜進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析,，突出顯示了在鎘存在下氨基酸庫(kù)發(fā)生修飾，谷胱甘肽合成增加,。
綜上所述,，該結(jié)果說(shuō)明LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜質(zhì)量分析器能夠發(fā)揮多面手的能力，對(duì)同一代謝指紋圖譜既可以做目標(biāo)分析又可做全面分析,。zui后,，由于LTQ的高靈敏度和Orbitrap質(zhì)量分析器的準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)量和寬動(dòng)態(tài)范圍,，有可能在幾分鐘內(nèi)獲得復(fù)雜和具有豐富信息的代謝指紋圖譜,，通過(guò)手工提取目標(biāo)分子的質(zhì)荷比信號(hào)或者通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)工具可分別進(jìn)行目標(biāo)和全局分析。
因?yàn)轱w行時(shí)間質(zhì)譜和四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜具有很高的掃描速率,，所以他們也非常適合對(duì)樣品進(jìn)行全面分析,。在內(nèi)標(biāo)校正下能得到質(zhì)量數(shù)小于5ppm的高分辨率。在質(zhì)量分辨率8000-12000可以將同重離子分開(kāi),。 (m/¢m,， FWHM，即zui大半峰寬),。
雖然通過(guò)減少離子抑制和通過(guò)保留時(shí)間,，準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù),，二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)化合物鑒定是有用的,，但是色譜分離影響被分析代謝指紋圖譜的信息量，因?yàn)槿鄙偃魏我环N固定相可以對(duì)代謝組中具有多樣性的化學(xué)組分實(shí)現(xiàn)*分離,。結(jié)果,，至少需要兩個(gè)色譜分析系統(tǒng)用于研究整個(gè)代謝組譜圖。 此外,，在多變量和單變量的數(shù)據(jù)分析方法學(xué)(背景噪聲抑制和色譜峰調(diào)整比對(duì)) 之前的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理仍然存在問(wèn)題,。一些分析相關(guān)的質(zhì)荷比信號(hào)會(huì)被排除，在對(duì)背景噪音消除過(guò)程中和對(duì)保留時(shí)間漂移的的校正時(shí)可能產(chǎn)生人為的假象,。在本文中,，在沒(méi)有任何前期的色譜分離步驟將生物樣品直接注入質(zhì)譜儀里對(duì)代謝組研究將是一個(gè)具有吸引力的選擇。
雖然直接注射質(zhì)譜分析(DIMS)已經(jīng)用低分辨質(zhì)譜或飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行了研究,，但是超高質(zhì)量分辨率儀器例如傅立葉變換離子回旋共振(FTICR)質(zhì)譜儀是上述方法的又一選擇,。通過(guò)在質(zhì)譜圖上的質(zhì)量數(shù)（亞ppm級(jí)的誤差）可以提供低分子量物質(zhì)(即分子量在1000以下)的元素組成，這無(wú)疑可以區(qū)分同重離子,。盡管具有相似質(zhì)量數(shù)代謝物不能被區(qū)分的,，但可以通過(guò)色譜分離實(shí)現(xiàn)辨別。也可以用各種活化模式進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析來(lái)實(shí)現(xiàn)分辨,。如對(duì)于荷正電的單電荷和多電荷可用持續(xù)失諧衰減輻射碰撞誘導(dǎo)解離和紅外多光子裂解,，對(duì)于帶多質(zhì)子離子進(jìn)行電子捕獲裂解和電子轉(zhuǎn)移解離裂解，對(duì)于帶多個(gè)負(fù)電的離子用EDD進(jìn)行裂解,。實(shí)現(xiàn)對(duì)子離子的質(zhì)荷比進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定,。然而，由于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR)在高強(qiáng)磁場(chǎng)下和昂貴費(fèi)用才能運(yùn)轉(zhuǎn),，而且常需要長(zhǎng)時(shí)間優(yōu)化,，故目前沒(méi)有普遍使用。如今，這個(gè)問(wèn)題被zui近出現(xiàn)的超高分辨率LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜所解決,。 該設(shè)備的前面部分是一個(gè)線性離子阱(二維離子阱),，它能記錄一級(jí)質(zhì)譜和來(lái)自前提離子選擇的多級(jí)質(zhì)譜圖。與傳統(tǒng)的三維離子肼相比,，線性離子肼能提供更好的動(dòng)態(tài)范圍,，較低的低質(zhì)量截止點(diǎn)，以及由于電子云分布在軸上而不是三維中心上故有較低的空間電荷效應(yīng),，因此提高了靈敏度,。離子在被注入到Orbitrap質(zhì)量分析器中首先被C肼短暫累積。離子不是通過(guò)錘型磁場(chǎng)捕捉,，而是儲(chǔ)存在由軸式中心電極和共軸外電極形成的靜電場(chǎng),。通過(guò)傅里葉變換過(guò)程得到不同質(zhì)荷比離子的震蕩頻率，可以準(zhǔn)確讀取質(zhì)荷比,。Orbitrap質(zhì)量分析器得到的瞬時(shí)信號(hào)與中心電極軸運(yùn)動(dòng)有關(guān),，是由于傅里葉回旋共振儀器的輻射回旋運(yùn)動(dòng)引起的。本文的研究目的是在質(zhì)譜檢測(cè)前沒(méi)有任何色譜系統(tǒng)分離的情況下,，用LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜快速對(duì)代謝指紋圖譜構(gòu)建進(jìn)行評(píng)價(jià),。目前為止, 這個(gè)理念的一個(gè)有利的證據(jù)是對(duì)酵母細(xì)胞提取物進(jìn)行了研究。通過(guò)流動(dòng)注射進(jìn)樣,，基于直接進(jìn)樣的方法,，我們發(fā)展了該方法并進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí),，報(bào)道了代謝物鑒定的方法,。然后將該方法應(yīng)用于受鎘毒害情況下酵母的代謝反應(yīng)。在*種目標(biāo)分析方式下,，從代謝指紋圖譜中提取生物相關(guān)的離子,，并與三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。在全局代謝組分析方式下,，通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)分析得到相同的代謝指紋圖譜,。
結(jié)論：
我們發(fā)展了能夠快速對(duì)代謝組指紋圖譜的一個(gè)新方法。它基于將生物樣品直接注入一臺(tái)新型雜交質(zhì)譜儀：LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜,。這個(gè)理念的一個(gè)有利的證據(jù)是通過(guò)流動(dòng)注射方式將酵母細(xì)胞提取物注入質(zhì)譜儀中,。在Orbitrap質(zhì)譜儀中的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)可以分辨同重離子，可以給出目標(biāo)離子和子離子的元素組成且誤差范圍小于5ppm,。通過(guò)線性離子肼的多級(jí)質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)量分析器對(duì)子離子準(zhǔn)確質(zhì)量的測(cè)定可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè),，雖然缺乏色譜分離而且是在低分辨的線性離子肼內(nèi)對(duì)母離子進(jìn)行選擇，但是本研究表明有可能通過(guò)子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)量分辨出同重離子,，有可能通過(guò)裂解方式不同區(qū)分同分異構(gòu)體,。
該方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng),、線性關(guān)系和批內(nèi)分析精密度進(jìn)樣了驗(yàn)證。 雖然方法的靈敏度受基質(zhì)效應(yīng)的影響,，卻是色譜方法的一種有競(jìng)爭(zhēng)力的選擇,，色譜方法有費(fèi)時(shí)，耐用性不好,，需要批間比對(duì)和數(shù)據(jù)處理等諸多缺點(diǎn)（即背景噪音抑制,，不同色譜圖保留時(shí)間漂移的校正）
當(dāng)研究鎘對(duì)酵母毒性時(shí)，雖然液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜的精密度比DIMS更高,，但是DIMS能得到與液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜相似的結(jié)果,。雖然DIMS不如液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜靈敏，但是卻能檢測(cè)大多數(shù)代謝物,。同一代謝指紋圖譜進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析,，突出顯示了在鎘存在下氨基酸庫(kù)發(fā)生修飾，谷胱甘肽合成增加,。
綜上所述,，該結(jié)果說(shuō)明LTQ Orbitrap組合質(zhì)譜質(zhì)量分析器能夠發(fā)揮多面手的能力，對(duì)同一代謝指紋圖譜既可以做目標(biāo)分析又可做全面分析,。zui后,，由于LTQ的高靈敏度和Orbitrap質(zhì)量分析器的準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)量和寬動(dòng)態(tài)范圍,，有可能在幾分鐘內(nèi)獲得復(fù)雜和具有豐富信息的代謝指紋圖譜,，通過(guò)手工提取目標(biāo)分子的質(zhì)荷比信號(hào)或者通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)工具可分別進(jìn)行目標(biāo)和全局分析。
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