高效液相色譜是目前應(yīng)用多的色譜分析方法，其分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇,。但是色譜填料的選擇范圍很寬,，分別為聚合物填料、硅膠基質(zhì)填料和其它無(wú)機(jī)填料,。要選擇合適的色譜填料,，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解,。

色譜填料的選擇

一、硅膠基質(zhì)填料

硅膠是HPLC填料比較普遍的基質(zhì),。除了具有無(wú)機(jī)物基質(zhì)共有的高強(qiáng)度,，還提供了一個(gè)表面，可以通過(guò)成熟的硅烷化技術(shù)鍵合范圍很廣的配基,，制成反相,、離子交換、疏水作用,、親水作用或分子排阻色譜,。硅膠基質(zhì)填料適用廣泛的溶劑，從極性到非極性,。其缺點(diǎn)是在水溶性堿性流動(dòng)相中不穩(wěn)定,。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為2～8,。

1,、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其它具有極性官能團(tuán),如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN,CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其它極性基團(tuán)極性較強(qiáng),，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極性大小,，即極性較弱的組份先被沖洗出色譜柱,。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正己烷(Hexane),、(Chloroform),、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

2,、反相色譜

反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì),，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng),，通常為水,、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物,。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組份先被沖洗出,，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。

常用的反相填料有：C18(ODS),、C8(MOS),、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等,。

二,、聚合物填料

聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,，其優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料,，這類填料具有較強(qiáng)的疏水性,，而且大孔的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。其缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料,，色譜柱柱效較低,。

三、其它無(wú)機(jī)填料

其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì),，一般僅限于特殊的用途,。

如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料,。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相,，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性,。

該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng),。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解,，這類柱可在任何PH與溫度下使用,。

氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng),，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床,，其優(yōu)點(diǎn)是可以在pH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng),，應(yīng)用范圍受到一定限制,，所以未能廣泛應(yīng)用。

新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC,。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,，應(yīng)用pH1～14，溫度可達(dá)100℃,。由于氧化鋯填料是近幾年才開(kāi)始研究,，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行之中,。

填料粒度的選擇

目前,，高效液相色譜柱廠家色譜填料粒度從1 um到超過(guò)30 um均有銷售，而目前分析分離主要用3um和5um填料進(jìn)行,。

填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù),，即柱效和背壓。粒度越小,，柱壓越大,，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應(yīng)用,。

在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度,，如果固定相選擇是正確,，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的,。

3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%,；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍,。

與此同時(shí),，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力,，但是柱長(zhǎng)更短,，以縮短分析時(shí)間。

另外,，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度,，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力,。

液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前,，要進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái),，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考,。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是適宜的條件)，只有這樣,，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品,、流動(dòng)相,、柱溫等條件的差異而有所不同。

1,、樣品的前處理 

可以使用流動(dòng)相溶解樣品,。

使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

使用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì),。

2,、流動(dòng)相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)期留在柱中),。

流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。

流動(dòng)相的黏度要盡量小,，以便得到好的分離效果,；降低柱壓降,，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。

流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng),。如使用UV檢測(cè)器,，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。

流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,，否則容易產(chǎn)生氣泡,，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。

在流動(dòng)相配制好后,，一定要進(jìn)行脫氣,。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用,。