樣品粉碎是提取毛發(fā)皮質(zhì)醇非常關鍵的一步,，從相關文獻中可以發(fā)現(xiàn)Davenport等對這一步驟的改進：起初為剪碎,，后來使用了德國萊馳MM200 進行研磨粉碎。我們使用了德國萊馳MM400,，并在文獻基礎上做了一定改進：將樣品放入液氮內(nèi)充分冷凍變脆后，再進行研磨,，這樣既可以使研磨粉末更細,、更均勻，又可以避免研磨過程中局部高溫對樣品造成的影響,。

    終用甲醇進行提取,。

    具體操作步驟：

（1）稱取 500 mg毛發(fā)樣品置于 15 mL玻璃試管中，加入10 mL異丙醇,。在室溫下將該試管放于調(diào)速多用振蕩器上洗滌 3 min（頻率 100 次/min）,，共洗滌 2 次；洗滌后的樣品置于電熱恒溫干燥箱內(nèi)，37℃干燥 8 h,。

（2）干燥后將樣品放入 80 mL小燒杯內(nèi),，用手術剪剪碎。之后放入 25 mL不銹鋼研磨罐內(nèi)（內(nèi)有 15 mm不銹鋼研磨球一個）,，擰緊后將罐放入液氮內(nèi)冷凍至液氮停止沸騰,。將研磨罐裝入冷凍混合型球磨儀MM400，研磨 2.5 min（頻率 26 Hz）,。

（3）稱取400 mg毛發(fā)粉末a,，置于 10 mL離心管內(nèi)，并加入 8 mL甲醇,。室溫下,，將離心管置于振蕩器，振蕩 24 h（頻率 230 次/min）,，提取皮質(zhì)醇,。

（4）將離心管離心 5 min（離心力 12 000 g,），取 4 mL上清液移入 5 mL離心管內(nèi),。

（5）在 5 mL離心管內(nèi)取 2 mL上清液放入2 mL離心管,，室溫用氮氣流進行干燥，樣品干燥后,，加入 5 mL離心管內(nèi)的剩余樣品,，繼續(xù)干燥（隨著甲醇的揮發(fā)，離心管內(nèi)出現(xiàn)懸浮物,。我們對這些懸浮物進行了研究）,。

（6）干燥后加入 0.5 mL PBS (磷酸緩沖液：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2 HPO4 1.44 g, KH2 PO4 0.24 g，加去離子水定容至 1 L,，將pH值調(diào)整到7.4)對樣品進行重構,。振蕩混勻后，放入−20℃冰箱內(nèi)儲存至檢測日,。
 

2,、實驗設計