污染向來(lái)是在細(xì)胞培養(yǎng)中的大問(wèn)題,。預(yù)防或治理污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素,。我們?cè)?strong>細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，在開(kāi)始階段就要十分重視污染問(wèn)題,，否則會(huì)前功盡棄,，這樣不僅浪費(fèi)時(shí)間,，也會(huì)浪費(fèi)人力、物力,。  

(一)  有哪幾類(lèi)污染,？

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的,、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì),，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。   

1,、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染,，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。?jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌,，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn),。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁,，pH改變,。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多,、增粗,，后變圓脫落死亡,。   

2、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中見(jiàn)的一種,，的真菌有煙曲霉,、黑曲菌、孔子霉,、毛霉菌,、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后,，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn),，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁,；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中,，有的呈鏈狀排列,。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,，但后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡,。

3、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的小微生物,，小直徑0.2μm,，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu),。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn),，能在偏堿條件下生存，對(duì)青霉素有抗藥性,。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間,。  

培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢,，部分細(xì)胞變圓,，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化,，或略有變化,，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染,。   

4,、非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染,。目前,，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。   細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生,，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致,。

（二）污染類(lèi)型的區(qū)別

1、細(xì)菌,、真菌污染的檢測(cè)

(1)  肉眼觀(guān)察 ---- 細(xì)菌,、真菌污染常在傳代、換液,、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生,，而且增生迅速，若有污染,，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀(guān)察到,，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起,。  

(2)  接種觀(guān)察 ---- 用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種,，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。   

(3)  鏡下觀(guān)察 ---- 倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,，即為細(xì)菌污染,。細(xì)胞之間有絲狀、管狀,、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染,。   

2、支原體污染的檢測(cè)

(1)  相差顯微鏡觀(guān)察 ---- 接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上,，再蓋上蓋片觀(guān)察,，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間,，有時(shí)可見(jiàn)類(lèi)似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn),。注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線(xiàn)粒體等相區(qū)別。  

(2)  熒光染色法觀(guān)察 ---- 熒光染料Hoechst33258,，此染料能與DNA特異地結(jié)合,，可使支原體內(nèi)的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn),，散在于細(xì)胞周?chē)蚋接诩?xì)胞表面,。  

(3)  電鏡檢測(cè) ---- 條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀(guān)察,。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí),，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋,、切片后才能進(jìn)行觀(guān)察,。  

(4)  培養(yǎng)檢測(cè) ---- 細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀(guān)察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀,，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中,，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀(guān)察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn),。  

3,、病毒的檢測(cè)

(1)  應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病  

(2)  逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測(cè)病毒