液相色譜法

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※ 液相色譜法,、液相色譜兩相的分類,、液相與氣相的區(qū)別

是繼氣相色譜之后，70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動(dòng)相的新色譜技術(shù),。

液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化 操作,。經(jīng)典的,，流動(dòng)相在常壓下輸送,，所用的固定相柱效低，分析周期長(zhǎng),。而現(xiàn)代引用了氣相色譜的理論,，流動(dòng)相改為高壓輸送（高輸送壓力可達(dá)4.9×107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）,；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器,，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此,，液相色譜具有分析速度快,、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn),。所以人們稱它為高壓,、高速、或現(xiàn)代,。

一,、液相色譜儀的兩相與分類

液相色譜分離原理及分類和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成,。液相色譜的固定相可以是吸附劑,、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠,；流動(dòng)相是各種溶劑,。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力,、分配系數(shù),、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用,，作用力的大小,，決定色譜過程的保留行為。

根據(jù)分離機(jī)制不同,，液相色譜可分為：液固吸附色譜,、液液分配色譜、化合鍵合色譜,、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型,。

二、液相色譜與氣相色譜的比較

液相色譜所用基本概念：保留值,、塔板數(shù),、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致,。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜基本一致,。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動(dòng)相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同,；此外,，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以,，液相色譜與氣相色譜有一定差別,，主要有以下幾方面：

（1）應(yīng)用范圍不同

氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對(duì)高沸點(diǎn)化合物,、非揮發(fā)性物質(zhì),、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分離,、分析較為困難,。致使其應(yīng)用受到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計(jì)只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析,；而液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制,，它非常適合分子量較大、難氣化,、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì),、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70 ～ 80%,。

（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作

因?yàn)椋?① 氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的,，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用,，樣品分子只與固定相相互作用,。而在液相色譜中流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素,。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相,，增大分離的選擇性。 ② 液相色譜固定相類型多,，如離子交換色譜和排阻色譜。等,，作為分析時(shí)選擇余地大,；而氣相色譜并不可能的。 ③  液相色譜通常在室溫下操作,，較低的溫度,，一般有利于色譜分離條件的選擇。

（3）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此,，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢,，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中,，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì),。

（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易,，而且回收是定量的,，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器,，儀器比較復(fù)雜,，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中,，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的,。綜上所述，具有高柱效,、高選擇性,、分析速度快、靈敏度高,、重復(fù)性好,、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一,，目前在化學(xué),、化工、醫(yī)藥,、生化,、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用,。

※       液相色譜儀的組成

液相色譜儀由 高壓輸液系統(tǒng),、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng),、檢測(cè)系統(tǒng),、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。

分析前,，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相,，開泵，沖洗柱子,，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后,，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測(cè)器的流通池,，后和洗脫液一起排入流出物收集器,。當(dāng)有樣品組分流過流通池時(shí)，檢測(cè)器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào),，經(jīng)過放大,，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性,、定量和評(píng)價(jià)柱效高低的依據(jù),。

一、高壓輸液系統(tǒng)

高壓輸液系統(tǒng)由 溶劑貯存器,、高壓泵,、梯度洗脫裝置和壓力表 等組成。

1.溶劑貯存器 溶劑貯存器一般由玻璃,、不銹鋼或氟塑料制成,，容量為1到2 L，用來貯存足夠數(shù)量,、符合要求的流動(dòng)相,。

2.高壓輸液泵 高壓輸液泵是液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng),，使樣品在色譜柱中完成分離過程,。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細(xì)，所填固定相粒度很小,，因此,，對(duì)流動(dòng)相的阻力較大，為了使流動(dòng)相能較快地流過色譜柱,，就需要高壓泵注入流動(dòng)相,。

對(duì)泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大,、流量恒定,、無脈動(dòng)，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右,。此外,，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好,。高壓輸液泵,，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵,，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透無關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化,，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化,，恒壓泵就能提供恒定的流量。

3. 梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例,，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度,、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化,，達(dá)到提高分離效果,，縮短分析時(shí)間的目的。

梯度洗脫裝置分為兩類：

一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度）,，流動(dòng)相在常溫常壓下混合,，用高壓泵壓柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可,。另一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度）,，將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序,，注入梯度混合室混合,，再輸柱系統(tǒng)。

梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度,，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值,，使所有譜帶都以佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫,，所不同的是,，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的,，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到,。

二、進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口,、注射器和進(jìn)樣閥等,，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。

三,、分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)包括色譜柱,、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成,。其內(nèi)徑為2 ～ 6mm,，柱長(zhǎng)為10 ～50cm，柱形多為直形,，內(nèi)部充滿微粒固定相,。柱溫一般為室溫或接近室溫,。

四、檢測(cè)器

檢測(cè)器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一,。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高,，重復(fù)性好、線性范圍寬,、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等,。在液相色譜中，有兩種類型的檢測(cè)器,，一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器,，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類檢測(cè)器的有紫外,、熒光,、電化學(xué)檢測(cè)器等；另一類是總體檢測(cè)器,，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng),。屬于此類檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器等。