紫外可見分光光度計(jì)一般應(yīng)用領(lǐng)域及檢測

分光光度計(jì)的簡單原理：

紫外可見分光光度計(jì)采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長的光源,，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收,，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。

   紫外可見分光光度計(jì) 核酸的定量：

核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。馬弗爐
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。
從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）,。后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個操作事項(xiàng),。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,，多肽,，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。箱式電阻爐

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）：

這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。
蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，的線性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。
漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。
蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快,，操作簡單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾,；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質(zhì)定量：

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry等幾種方法,。
Lowry法：以早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn),。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比,，Lowry法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長,；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA，Tritonx-100,，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。
BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+,，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物,，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對于Lowry法,，操作簡單，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。
Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其特點(diǎn)是,，敏感度好，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍,；操作更簡單,，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時,，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry,，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的,。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性,。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry,，BCA測出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著。即使是測定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml,。因此，在選擇比色法之前,，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外,，比色法定量蛋白質(zhì),，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問題是,，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品）,，都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低,。除此，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因,。此外，非常重要的是,，是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,。

細(xì)菌細(xì)胞密度（OD600）：

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng),，發(fā)生變色反應(yīng),。另外，需要注意的是,，測試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。

分光光度計(jì)的重要配件——比色杯：

比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯,、玻璃杯以及塑料杯,。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等,。一般測試核酸和紫外定量蛋白,，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定,。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色,，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。