紫外可見分光光度計(jì)一般應(yīng)用領(lǐng)域及檢測(cè)

分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理：

紫外可見分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收,，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。

   紫外可見分光光度計(jì) 核酸的定量：

核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液,。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。馬弗爐
事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí),，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果,。為了程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定。
從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計(jì)的測(cè)試范圍）,。后是操作因素，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。箱式電阻爐

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）：

這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白,。選擇Warburg公式,，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。
蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單,，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”,。與測(cè)試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，的線性范圍在1.0-1.5之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí),，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象,。事實(shí)上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。
漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會(huì)被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測(cè)試較純凈,、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說,，速度快,，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,。

比色法蛋白質(zhì)定量：

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry等幾種方法。
Lowry法：以早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn),。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret相比,，Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng),；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA,，Tritonx-100,，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng),。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法,，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。
Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其特點(diǎn)是,，敏感度好,，是Lowry和BCA兩種測(cè)試方法的2倍；操作更簡(jiǎn)單,，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容,。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性,。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑，究竟該相信哪種方法,？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白,，結(jié)果Lowry,，BCA測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著,。即使是測(cè)定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致,。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml。因此,，在選擇比色法之前,，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試,。時(shí)間過長(zhǎng),，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低,。除此,，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因,。此外,，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。

細(xì)菌細(xì)胞密度（OD600）：

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期,，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。為了保證正確操作,，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線,。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng),，發(fā)生變色反應(yīng)。另外,，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。

分光光度計(jì)的重要配件——比色杯：

比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯,。根據(jù)不同的測(cè)量體積,，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白,，均采用石英杯或者玻璃杯,，但是不適合比色法測(cè)定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色,，所以必須采用一次性的塑料杯,。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。