超微量分光光度計SMA5000是一類很重要的生物實驗室分析儀器,無論在物理學(xué),、化學(xué),、生物學(xué)、醫(yī)學(xué),、材料學(xué),、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥,、環(huán)境檢測,、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用。超微量分光光度計SMA5000就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器,，常用于核酸,，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率Gao的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的Gao吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液,。然而，實驗并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。

事實上,，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準確度和度,。如斯達沃SMA5000超微量分光光度計的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,，都是正常的,。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的Da程度pH值,，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值Hao在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）,。后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負值,；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度,，超微量分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。

蛋白質(zhì)直接定量

這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式，超微量分光光度計SMA5000可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm 的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，Jia的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個正常的現(xiàn)象,。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高,。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry 等幾種方法,。

Lowry 法：以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進,。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),，產(chǎn)生藍色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,，Lowry 法敏感性更高,。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長,；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,，操作簡單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特點是,，敏感度好,，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單,，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時,，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry,，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的,。主要的缺點是不同的標準品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團以及顯色基團不一,，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性,。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry,，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著。即使是測定同一樣品,，同一種比色法選擇的標準樣品不一致,，測試后的濃度也不一致,。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標準品,，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml,。因此,，在選擇比色法之前，Hao是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品,。另外，比色法定量蛋白質(zhì),，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,，反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間，所有的樣品（包括標準樣品）,，都必須在此時間內(nèi)測試,。時間過長，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低,。除此，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因,。此外，非常重要的是,，Hao是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準確,。

斯達沃SMA5000

實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度,。在遇到要求較高的實驗,，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。斯達沃SMA5000是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù),，做出校正曲線,。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細菌培養(yǎng)一段時間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。另外,，需注意的是，測試的樣品不能離心,，保持細菌懸浮狀態(tài),。